何華軍，張輝，夏麗敏，王遠(yuǎn)遠(yuǎn)

(1.景寧畬族自治縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江 麗水 323500；2.景寧畬族自治縣生態(tài)林業(yè)發(fā)展中心，浙江 麗水 323500；3.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310051)

黃精，習(xí)稱雞頭參、老虎姜、九蒸姜、野山姜、千年運(yùn)等，為百合科黃精屬的多年生草本植物，以根莖入藥，是我國(guó)傳統(tǒng)的“藥食同源”滋補(bǔ)中藥材之一，具有悠久的藥用歷史和確切的臨床療效[1]。浙江省作為黃精主產(chǎn)區(qū)之一，擁有優(yōu)越的林業(yè)生態(tài)資源，尤其是林下自然環(huán)境[2]。近幾年黃精的人工種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，種植過程中也出現(xiàn)了各種病蟲害問題，并有愈發(fā)嚴(yán)重的趨勢(shì)[3]。在黃精種植過程中化肥農(nóng)藥不規(guī)范、超量使用現(xiàn)象仍然較多，存在較大的環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。因此，《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)四部通則農(nóng)藥殘留量測(cè)定法(2341)[6]新增了第五法“藥材及飲片(植物類)中禁用農(nóng)藥多殘留測(cè)定法”，進(jìn)一步規(guī)范和限制中藥材種植過程的農(nóng)藥使用，推動(dòng)中醫(yī)藥市場(chǎng)健康發(fā)展。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)作為農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法之一，適用于分析受熱易分解、分子量較大、不適用于氣相色譜分析的農(nóng)藥[7-8]，該檢測(cè)方法靈敏度高，定性定量檢測(cè)可以同時(shí)進(jìn)行，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。QuEChERS方法作為一種操作快速、高效、簡(jiǎn)單的樣品萃取與基質(zhì)凈化技術(shù)，最初由美國(guó)農(nóng)業(yè)部Anastassiades等[9]開發(fā)，該方法因其簡(jiǎn)單和高通量而被廣泛接受，而且大多數(shù)農(nóng)藥的回收率較高[10]。但中藥材的基質(zhì)復(fù)雜、雜質(zhì)多、干擾多，傳統(tǒng)的QuEChERS方法并不能適用于各種不同基質(zhì)的藥材，因此，需要針對(duì)部分藥材基質(zhì)對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的檢測(cè)條件[11-13]。

本文以麗水市黃精種植企業(yè)生產(chǎn)的黃精為研究對(duì)象，以《中華人民共和國(guó)藥典》 (2020年版)四部通則為指導(dǎo)，利用改進(jìn)QuEChERS方法對(duì)黃精樣品進(jìn)行提取凈化，采用UPLC-MS/MS法同時(shí)對(duì)23種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQS 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司；ST-16R 高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；XH-B 漩渦混合器：江蘇天翎儀器有限公司；PP020XXM1 超純水器：英國(guó)ELGA公司；GM 200刀式研磨儀：弗爾德(上海)儀器設(shè)備有限公司；ME 104電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

23種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為1 000 mg·L-1)：氧樂果、多菌靈、噻蟲嗪、吡蟲啉、樂果、啶蟲脒、嘧霉胺、烯酰嗎啉、腈菌唑、嘧菌酯、氟環(huán)唑、聯(lián)苯肼酯、馬拉硫磷、三唑磷、咪鮮胺、倍硫磷、二嗪農(nóng)、辛硫磷、茚蟲威、丙溴磷、增效醚、毒死蜱、噠螨靈，均由壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司提供。

乙腈(色譜級(jí))：德國(guó)默克公司；甲酸(色譜級(jí))、QuEChERS提取鹽包(6 g無水硫酸鎂，1.5 g無水乙酸鈉)：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；乙酸銨(分析純)：上海展云化工有限公司；冰醋酸(分析純)：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；無水硫酸鎂(MgSO4，分析純)：南京化學(xué)試劑股份有限公司；N-丙基乙二胺(PSA，40～63 μm)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18，40～63 μm)、石墨化碳黑(GCB，120～400目)、硅膠(48～74 μm)：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取23種標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥物質(zhì)各1.0 mL分別加入到10 mL容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光冷藏保存。取空白黃精基質(zhì)，梯度稀釋至不同質(zhì)量濃度(0.5、1、5、10、20、50 ng·mL-1)的溶液，即得。

1.3 檢測(cè)條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：40 ℃；流速：0.45 mL·min-1；流動(dòng)相A：乙腈-0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸溶液(含5 mmol·L-1甲酸銨)；洗脫：0～0.25 min，2%A；0.25～7.75 min，2%～99%A；7.75～8.5 min，2%A；8.50～10.00 min，2%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件

以Waters Xevo TQS LC-MS-MS聯(lián)用儀檢測(cè)，電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；正離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multi reaction monitoring，MRM)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑(氮?dú)?流速：1 000 L·h-1；溫度：450 ℃。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 供試品溶液的制備

取供試品粉末(過孔徑0.25 mm篩)3 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤(rùn)，靜置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋混勻，置恒溫振蕩器中振蕩5 min，加入QuEChERS提取鹽包，立即搖散，再置恒溫振蕩器于5 ℃下振蕩5 min，離心(5 ℃，5 000 r·min-1)5 min，取上清液9 mL于預(yù)先裝有C18(300 mg)、PSA(300 mg)、硅膠(100 mg)的15 mL凈化管中，渦旋混勻，置恒溫振蕩器振蕩5 min，離心(5 000 r·min-1)5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，即得。

1.4.2 空白基質(zhì)液的制備

取空白基質(zhì)樣品，同供試品溶液的制備方法(1.4.1節(jié))處理成空白基質(zhì)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS/MS條件的選擇

用適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過LC-MS/MS 的Intellistart調(diào)諧程序，優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，選擇相對(duì)豐度較高、出峰穩(wěn)定的離子碎片，獲得了23種農(nóng)藥最優(yōu)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)，如表1所示。23種農(nóng)藥目標(biāo)物的總離子流圖如圖1所示。

圖1 23種農(nóng)藥MRM總離子流圖Fig.1 MRM total ion flow diagram of 23 pesticides

表1 23種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)及液相保留時(shí)間Table 1 Mass spectrometry parameters and liquid phase retention time of 23 pesticides

2.2 QuEChERS法的優(yōu)化

2.2.1 GCB對(duì)23種農(nóng)藥吸附的影響

GCB作為常用的QuEChERS凈化吸附劑有去除色素的作用，如類胡蘿卜素和葉綠素，但它們二者對(duì)含苯官能團(tuán)的化合物有較強(qiáng)吸附作用，會(huì)降低其回收率[14]。因此，本試驗(yàn)對(duì)空白黃精樣品進(jìn)行加標(biāo)，比較其加標(biāo)回收率，加標(biāo)量為50 μg·kg-1，在含有900 mg無水硫酸鎂、300 mg PSA、300 mg C18、300 mg硅膠凈化條件下分別考察了不同GCB使用量下(0、30、60和90 mg)23種農(nóng)藥回收率的影響，結(jié)果見圖2。如圖2所示，多菌靈、嘧霉胺、聯(lián)苯肼酯、咪鮮胺、毒死蜱的回收率隨著GCB用量的增加明顯下降，可能與其較強(qiáng)的吸附作用有關(guān)。當(dāng)GCB用量為0時(shí)，剩余農(nóng)藥的回收率相比其他3組差別不大，因此，本試驗(yàn)不使用GCB作為凈化材料。

圖2 不同GCB使用量下23種農(nóng)藥回收率Fig.2 Recovery rates of 23 pesticides under different GCB usage levels

2.2.2 硅膠對(duì)23種農(nóng)藥吸附的影響

由于在單獨(dú)使用PSA或者C18作為凈化劑時(shí)，樂果、馬拉硫磷、辛硫磷、咪鮮胺等多種農(nóng)藥的回收率明顯受到凈化條件的影響，不符合檢測(cè)要求，為進(jìn)一步探尋成本更低，更加綠色的檢測(cè)方法，本試驗(yàn)在含有900 mg無水硫酸鎂、300 mgPSA、300 mgC18凈化條件下分別考察了不同硅膠使用量下(0、100、200和300 mg)23種農(nóng)藥回收率的影響，結(jié)果見圖3。如圖3所示，當(dāng)硅膠使用量為0時(shí)，辛硫磷回收率較低，其他3組各農(nóng)藥回收率相差較小，且都能滿足檢測(cè)要求，考慮到試驗(yàn)成本，選擇硅膠用量100 mg為最佳條件。

圖3 不同硅膠使用量下23種農(nóng)藥回收率Fig.3 Recovery rates of 23 pesticides under different silicone usage levels

綜上所述，當(dāng)無水硫酸鎂(900 mg)、PSA(300 mg)、C18(300 mg)、硅膠(100 mg)組合作為凈化劑時(shí)，23種農(nóng)藥的回收率在77.49%～107.11%，滿足農(nóng)殘檢測(cè)的要求，檢測(cè)成本也更低。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇該組合作為凈化劑。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由于不同化合物在LC-MS/MS分析中對(duì)電噴霧界面的電離效率會(huì)有不同的影響，這種影響表現(xiàn)為離子增強(qiáng)或抑制，容易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有不同程度的誤差。本試驗(yàn)的基質(zhì)效應(yīng)(ME)根據(jù)公式“ME等于基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率除以溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率減去1再乘以100%”進(jìn)行評(píng)估，當(dāng)ME>0時(shí)，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME<0時(shí)，為基質(zhì)抑制效應(yīng)。此外，若|ME|≤20%，表示弱基質(zhì)效應(yīng)；若|ME|在20%～50%，則表示中等基質(zhì)效應(yīng)；若|ME|>50%，表示強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[15-16]。結(jié)果見表2，在黃精基質(zhì)中嘧霉胺具有強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，吡蟲啉和聯(lián)苯肼酯具有中等基質(zhì)效應(yīng)，其余農(nóng)藥具有弱基質(zhì)效應(yīng)。本試驗(yàn)采用黃精基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線對(duì)黃精中23種農(nóng)藥定量，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。

表2 23種農(nóng)藥的線性方程、 相關(guān)系數(shù)、 基質(zhì)效應(yīng)、 檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，matrix effects，detection limits，and quantification limits of 23 pesticides

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，將一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用空白基質(zhì)液梯度稀釋成6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，根據(jù)色譜條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制23種農(nóng)藥的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比S/N=3時(shí)確定檢測(cè)限(LOD)，以信噪比S/N=10時(shí)確定定量限(LOQ)。

23種農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限、檢出限見表2。

23種農(nóng)藥化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為0.5～50.0 ng·mL-1，線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.995 5，23種農(nóng)藥化合物的LOQs和LODs分別為0.04～3.29 μg·kg-1和0.01～0.99 μg·kg-1，檢出限均低于《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)四部通則農(nóng)藥殘留量測(cè)定法(2341)第五法，可以滿足檢測(cè)要求。

在黃精空白基質(zhì)中加入低(10 μg·kg-1)、中(25 μg·kg-1)、高(100 μg·kg-1)3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.4.1節(jié)進(jìn)行樣品前處理，測(cè)定回收率，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)，結(jié)果見表3。3個(gè)不同濃度水平下的加標(biāo)回收率分別為83.36%～114.52%、75.61%～101.38%、82.29%～103.15%，RSDs 分別為1.26%～9.99%、0.61%～7.08%、0.64%～4.43%，方法回收率和精密度均滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

表3 黃精基質(zhì)中23種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recovery rates and relative standard deviations of 23 pesticides in Polygonatum sibiricum matrix

3 結(jié)論與討論

本文通過對(duì)凈化條件、質(zhì)譜條件等優(yōu)化，確定黃精中23種農(nóng)藥多殘留的 QuEChERS前處理方法，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，23種農(nóng)藥的 LOD為0.01～0.99 μg·kg-1，LOQ為 0.04～3.29 μg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.995 5～0.999 9，加標(biāo)回收率在75.61%～114.52%，RSD在0.61%～9.99%。本文所建立的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、高效靈敏、準(zhǔn)確可靠，可為黃精中相關(guān)農(nóng)藥的殘留監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。