呂路瓊，歐陽由男，葉淑珍，游雨欣，李斌，王艷麗

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室 浙江省國家農(nóng)作物品種抗性鑒定試驗站，浙江 杭州 310021；2.中國水稻研究所，浙江 杭州 310006；3.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058)

植物在生長過程中為微生物的生長和增殖提供大量生態(tài)位，如植物的內(nèi)部[1]、根際[2]和葉際[3]，這些微生物群體及其基因組統(tǒng)稱為植物微生物組[4]。其中，與植物根部相關(guān)的微生物具有豐富多樣性，大約有數(shù)萬種，因而復(fù)雜的根際微生物又被稱為植物的第二基因組[2]。伴隨著植物的生命周期，根際微生物群落在植物營養(yǎng)和健康方面具有巨大潛力，如維持土壤功能、產(chǎn)生植物激素、抑制病原菌等多種途徑，促進(jìn)植物的生長發(fā)育、增強植物抗病性，是植物健康和生產(chǎn)力的關(guān)鍵因素[5]。由于根際微生物的復(fù)雜和重要程度，近年來受到了廣泛關(guān)注[6]。

目前分離和培養(yǎng)植物有益微生物具有重要意義。這些分離到的微生物可以作為植物菌劑促進(jìn)植物生長[7]、抵御生物脅迫[8]與非生物脅迫[9]。然而受培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)條件等多種因素影響，在微生物培養(yǎng)過程中可實現(xiàn)不同種類微生物富集。例如在蘆薈根內(nèi)生細(xì)菌群落組成的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)變形菌門在植物混合提取物培養(yǎng)基上為優(yōu)勢菌門，厚壁菌門在化學(xué)合成培養(yǎng)基上為優(yōu)勢菌門[10]。并且部分有益微生物在群體中比例較低，分離培養(yǎng)時很容易忽略，難以使研究者完整地理解植物微生物組及其整體功能。目前高通量測序技術(shù)已被廣泛采用[11]，因為它們可以在一個樣本中鑒定出數(shù)千到數(shù)百萬個序列，揭示稀有微生物物種的豐度。

為探究不同培養(yǎng)方式對小麥根際微生物群落結(jié)構(gòu)影響，本研究對小麥根際微生物取樣后置于兩種培養(yǎng)基與兩個充氧量進(jìn)行培養(yǎng)，5 d后進(jìn)行16S rRNA高通量測序，從而揭示小麥可培養(yǎng)根際微生物群落特征，為小麥根際微生物資源開發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取中國水稻研究所試驗田(杭州市富陽區(qū)黃田畈)種植的冬小麥揚麥20植株，試驗田面積1 334 m2，按照“五點取樣法”，每個取樣點選取生長健壯一致的小麥植株3株，先用農(nóng)具將冬小麥植株松土，取出根系，除去根系上附著的泥土顆粒，沿植株基部剪去根系，稱重100 g根系，用1 L蒸餾水清洗麥根，用定性濾紙過濾，即為冬小麥根際微生物菌種，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2 培養(yǎng)基

大米加工的細(xì)米糠 (M培養(yǎng)基)：米糠50 g(由浙江國稻高科技種業(yè)有限公司稻米加工廠提供)，蒸餾水1 000 mL。

LANDY改良配方培養(yǎng)基(L培養(yǎng)基)：葡萄糖20 g，L-谷氨酸鈉5 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，蒸餾水1 000 mL。

LANDY培養(yǎng)基(D 培養(yǎng)基)：葡萄糖 20 g，L-谷氨酸鈉5 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.15 mg，硫酸錳5 mg，硫酸銅0.16 mg，蒸餾水1 000 mL。

1.3 培養(yǎng)方法

將100 mL根際土壤溶液分別接種于M培養(yǎng)基(M處理)、L 培養(yǎng)基(L處理)和D 培養(yǎng)基(D處理)中，在微生物培養(yǎng)基(自主研發(fā)，ZL202120770944.2)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 28.5 ℃、充氧泵空氣流量為100 L·min-1。將100 mL根際土壤溶液接種于L培養(yǎng)基，置于發(fā)酵罐(型號：JBF-100)培養(yǎng)作為對照，培養(yǎng)溫度為28.5 ℃，充氧泵空氣流量為8 L·h-1。培養(yǎng)5 d后收集樣品并盡快測樣。

1.4 DNA提取

根據(jù)制造商的說明，使用OMEGA土壤DNA分離試劑盒(OMEGA，Bio-Tek，Norcross，Norcross，GA，USA)從樣品中提取總基因組DNA。使用NanoDrop (ND-1000)分光光度計(賽默飛世爾科學(xué)公司，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國)測定提取DNA的質(zhì)量。采用通用正向引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和通用反向引物806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對可培養(yǎng)根際細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴增。將純化的擴增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，Illumina PE250上機測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用R語言繪制箱線圖，使用GraphPad Prism 8進(jìn)行顯著性分析，并繪制堆積柱形圖與條形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alpha多樣性分析

為分析不同培養(yǎng)基對大麥根際微生物培養(yǎng)的群落差異，本研究分別使用M與L 2種培養(yǎng)基，在微生物培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以置于發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的L培養(yǎng)基作為對照，在培養(yǎng)5 d后收集不同處理的微生物樣本(每個處理7個重復(fù))，進(jìn)行16S rRNA擴增子測序。共獲得有效序列2 675 135條，平均每個樣本127 387條序列，對應(yīng) 17個門、28個綱、49個目、74個科、124個屬。

Alpha多樣性是指特定生境或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的物種的豐富程度與多樣性情況。Chao1指數(shù)主要關(guān)心樣本的物種豐富度信息，數(shù)值越大，多樣性越高。Shannon指數(shù)綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度，數(shù)值越大，多樣性越高。如圖1所示，3種處理的Alpha多樣性存在顯著差異。其中D處理與M處理Chao1指數(shù)顯著高于L處理，M處理的Shannon指數(shù)顯著高于L處理且與D處理無顯著差異。說明D處理與M處理豐富度與多樣性高于L處理。

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。A—Chao1指數(shù)；B—Shannon指數(shù)。圖1 微生物群落 Alpha多樣性分析Fig.1 Alpha diversity analysis of microbial community

2.2 群落組成分析

如圖2中A所示，在綱水平上，小麥根際可培養(yǎng)微生物群落主要由γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，擬桿菌綱(Bacteroidia)和芽孢桿菌綱(Bacilli)組成。其中D處理中γ-變形菌綱、擬桿菌綱和芽孢桿菌綱分別占比66.40%，17.44%，5.54%；L處理中γ-變形菌綱、擬桿菌綱和芽孢桿菌綱分別占比38.13%，3.61%，24.70%；M處理中γ-變形菌綱、擬桿菌綱和芽孢桿菌綱分別占比81.33%，3.09%，13.56%。如圖2中B所示，在屬水平上，大麥根際可培養(yǎng)微生物群落主要由克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，普雷沃氏菌屬(Prevotella_9)和氣單胞菌屬(Aeromonas)組成。其中D處理中克雷伯氏菌屬，普雷沃氏菌屬和氣單胞菌屬分別占比43.88%，12.35%，5.86%；L處理中克雷伯氏菌屬，普雷沃氏菌屬和氣單胞菌屬分別占比8.61%，31.36%，12.72%；M處理中克雷伯氏菌屬，普雷沃氏菌屬和氣單胞菌屬分別占比9.41%，16.39%，24.00%。以上研究結(jié)果表明，大麥根際可培養(yǎng)微生物具有豐富的多樣性，且不同培養(yǎng)條件對大麥根際微生物富集類群有很大差別。

A—綱水平；B—屬水平。圖2 小麥根際可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成分析Fig.2 Analysis of the composition of cultivable bacterial communities in the wheat rhizosphere

2.3 FAPROTAX功能預(yù)測

FAPROTAX功能預(yù)測是利用多個已發(fā)表的可培養(yǎng)菌文章及自身的原核功能數(shù)據(jù)庫，根據(jù)輸入運算分類單元(OTU)信息提取功能完成預(yù)測。圖3為3個處理間對應(yīng)細(xì)菌群落功能注釋預(yù)測的結(jié)果，不同處理樣品之間細(xì)菌群落功能注釋的預(yù)測結(jié)果存在很大差別。把細(xì)菌群落功能注釋排名前10的表現(xiàn)出來，分為5個大類：化能異養(yǎng)、發(fā)酵、碳循環(huán)、氮循環(huán)、鐵呼吸。D處理中與發(fā)酵、有氧化學(xué)異養(yǎng)、硝酸鹽還原、固氮作用等功能相關(guān)的細(xì)菌群落相對豐度最高；L處理中與氮氣呼吸、亞硝酸呼吸及亞硝酸氨化等功能相關(guān)的細(xì)菌群落相對豐度最高；M處理中與化能異樣、芳香族化合物降解和鐵呼吸作用等功能相關(guān)的細(xì)菌群落相對豐度最高。以上研究結(jié)果表明，大麥根際微生物含有多類植物有益菌，且不同培養(yǎng)方式會通過影響可培養(yǎng)微生物群落組成而影響其功能。

圖3 小麥根際可培養(yǎng)微生物功能預(yù)測Fig.3 Function prediction of cultivable microorganisms in wheat rhizosphere

3 結(jié)論與討論

在植物生長過程中，土壤微生物對其生長發(fā)育有著關(guān)鍵作用，因此，研究土壤微生物對促進(jìn)農(nóng)作物生長并提高產(chǎn)量具有關(guān)鍵作用[12]。然而自然環(huán)境中的微生物大多處于“貧營養(yǎng)”但營養(yǎng)元素豐富的狀態(tài)，實驗室中很難對自然環(huán)境進(jìn)行模擬。同時在分離培養(yǎng)過程中，富營養(yǎng)細(xì)菌大量生長抑制寡營養(yǎng)細(xì)菌生長。目前能夠在微生物培養(yǎng)基上形成菌落的細(xì)菌數(shù)量通常只占土壤中細(xì)菌總數(shù)的一小部分[13]。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基類型和氧氣含量都會影響根際微生物群落組成[14]。本實驗分別選用天然培養(yǎng)基與化學(xué)培養(yǎng)基，在兩種充氧量下培養(yǎng)小麥根際微生物，5 d后采用16S rRNA高通量測序，以研究培養(yǎng)基類型與充氧量對小麥根際微生物影響。

在本實驗中，使用高充氧量(微生物培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)時，米糠培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌群落Alpha多樣性高于LANDY改良配方培養(yǎng)基，表明天然培養(yǎng)基比化學(xué)培養(yǎng)基更有助于微生物培養(yǎng)。M處理中變形菌綱相對豐度最高，表明變形菌綱更易受培養(yǎng)基類型影響，該結(jié)果與前人[11]結(jié)果一致。自然培養(yǎng)基中含有大量未知天然營養(yǎng)成分，更適于微生物生長。在同時使用LANDY改良配方培養(yǎng)基時，低充氧量(發(fā)酵罐)的微生物群落Alpha多樣性高于高充氧量環(huán)境(微生物培養(yǎng)基)，說明根際微生物存在于土壤內(nèi)層，在培養(yǎng)過程中并不需要大量氧氣。L處理中擬桿菌綱和芽孢桿菌綱相對豐度最高，表明這兩種菌更易受充氧量影響。氧氣含量在微生物培養(yǎng)過程中起到關(guān)鍵作用，這與前人[15]結(jié)果一致。

對小麥根際可培養(yǎng)微生物進(jìn)行功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)其含有很多促生菌，主要與化能異養(yǎng)、發(fā)酵、碳循環(huán)、氮循環(huán)、鐵呼吸等功能相關(guān)。由此推測小麥根際富含的優(yōu)勢菌群對植物生長與健康具有重要作用。γ-變形菌綱在生理、形態(tài)和代謝等方面呈現(xiàn)出豐富的多樣性，對環(huán)境適應(yīng)性強，繁殖速度快，在生態(tài)系統(tǒng)尤其是土壤系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位[16，17]。γ-變形菌綱對碳氮循環(huán)具有重要意義[18]，也在適應(yīng)環(huán)境變化和抵御逆境脅迫方面發(fā)揮重要作用。擬桿菌綱與變形菌綱也是氮循環(huán)的主要貢獻(xiàn)者。研究發(fā)現(xiàn)，隨著施氮量的增加，優(yōu)勢類群中擬桿菌和變形菌相對豐度提高。嗜中性微好氧 FeOB均為變形菌門[19]。

本研究通過測定3種培養(yǎng)條件對小麥根際可培養(yǎng)微生物影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)基類型和充氧量會顯著影響小麥根際微生物富集。小麥根際微生物含有大量與植物促生相關(guān)微生物，對農(nóng)作物生長具有關(guān)鍵作用。