童奇?zhèn)?周吉亮 羅珊珊 曹天旭 蔣佳穎 杜萍*

響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草液體發(fā)酵配方及條件的研究

童奇?zhèn)?周吉亮2羅珊珊2曹天旭2蔣佳穎2杜萍2*

（1. 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 萬(wàn)州 404100；2. 長(zhǎng)江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 涪陵 408100）

蛹蟲草是一種珍稀的藥食兩用真菌，為提高其菌絲體的液體發(fā)酵效率，首先通過單因素試驗(yàn)確定了蛹蟲草液體發(fā)酵的最優(yōu)碳源、氮源及適宜培養(yǎng)的pH、溫度、裝液量和轉(zhuǎn)速6個(gè)因素。然后采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定葡萄糖、牛肉膏、溫度是影響蛹蟲草液體發(fā)酵菌絲體生物量的關(guān)鍵因素。利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，最終獲得蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵的最佳配方及條件為：牛肉膏13.34 g/L、葡萄糖20.00 g/L、MgSO41.5 g/L、KH2PO41.5 g/L，pH 6.5，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度27 ℃。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，優(yōu)化后條件培養(yǎng)的菌絲生物量可達(dá)1.489 g/105 mL，是優(yōu)化前的2倍，與模型預(yù)測(cè)值基本一致，優(yōu)化效果較好，可為蛹蟲草液體深層發(fā)酵培養(yǎng)及后續(xù)工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

蛹蟲草；液體發(fā)酵；響應(yīng)面法；菌絲生物量

蛹蟲草（）又名北冬蟲夏草，是子囊菌亞門、麥角菌科、蟲草屬的一種藥食兩用真菌[1-3]。蛹蟲草與珍稀藥用菌冬蟲夏草在有效成分、功效等方面有諸多相似之處。相比冬蟲夏草，蛹蟲草還具有生長(zhǎng)周期短、更易人工培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，蛹蟲草作為冬蟲夏草的替代品被廣泛開發(fā)利用，其子實(shí)體富含蟲草多糖、蟲草素和甾醇類等多種活性成分[4-6]。蟲草素（Cordyce-pin）作為其利用最為廣泛的活性成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒等功效，常被用來(lái)治療人體免疫方面的疾病[7-9]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)法因生產(chǎn)周期短、可連續(xù)發(fā)酵、便捷、獲取發(fā)酵活性物質(zhì)成本低而被廣泛應(yīng)用。蛹蟲草液體培養(yǎng)菌絲體的化學(xué)組成與子實(shí)體接近[10]，其液體培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件的研究多采用單因素或正交試驗(yàn)方法，選取的培養(yǎng)基配方及條件的因素不夠全面，得到的工藝條件有較大偏差。響應(yīng)面分析法通過回歸方程分析優(yōu)化試驗(yàn)條件，預(yù)測(cè)響應(yīng)值，反映各因素之間對(duì)結(jié)果的交互影響，可有效確定多個(gè)影響因子的最佳組合條件。因此，本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草液體發(fā)酵配方及條件，為提高工業(yè)發(fā)酵蛹蟲草菌絲體生物量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種。蛹蟲草母種為野生標(biāo)本分離菌種，菌株編號(hào)為JLCY-LI819，標(biāo)本于2016年7月16日由北華大學(xué)林學(xué)院由士江采自吉林省吉林市永吉縣口前鎮(zhèn)，經(jīng)ITS序列鑒定為，即蛹蟲草，基因序列號(hào)為MT525327，現(xiàn)保存于長(zhǎng)江師范學(xué)院食用菌栽培實(shí)驗(yàn)室。

供試培養(yǎng)基配方。PDA培養(yǎng)基（用于母種擴(kuò)繁）：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L，pH自然?；A(chǔ)培養(yǎng)基：碳源20 g/L、氮源10 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

（1）碳源試驗(yàn)。設(shè)葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、甘露醇、糊精、乳糖、可溶性淀粉和麥芽糖9種供試碳源，分別添加到以蛋白胨為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，250 mL錐形瓶裝液量為100 mL，常規(guī)方法制備培養(yǎng)液，待滅菌冷卻后接入2塊1 cm2大小的蛹蟲草菌塊，于27 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)7天，每天觀察菌絲生長(zhǎng)情況及長(zhǎng)勢(shì)，培養(yǎng)結(jié)束后，用純凈水將菌絲體沖洗干凈，置于50 ℃烘箱干燥至恒重后測(cè)定菌絲生物量（干重），每處理5次重復(fù)。

（2）氮源試驗(yàn)。設(shè)尿素、硝酸銨、蛋白胨、麩皮、麥芽浸膏、酵母膏與牛肉膏7種供試氮源，分別添加到以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其他操作同碳源試驗(yàn)，下同。

（3）pH試驗(yàn)。采用葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液的pH分別調(diào)節(jié)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5與8.0。

（4）溫度試驗(yàn)。采用葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為19、21、23、25、27與31 ℃。

（5）轉(zhuǎn)速試驗(yàn)。采用葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)到6.5，轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為110、120、130、140、150與160 r/min。

（6）裝液量試驗(yàn)。采用葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)到6.5，轉(zhuǎn)速130 r/min，裝液量分別設(shè)置為30、45、60、75、90、105、120與130 mL。

1.2.2 蛹蟲草液體發(fā)酵Plackett-Burman設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以菌絲體生物量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)6因素2水平的Placket-Burman響應(yīng)面試驗(yàn)（表1），篩選對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)影響顯著的因素，并分析不同因素間的相互作用。

1.2.3 蛹蟲草液體發(fā)酵Box-Behnken 試驗(yàn)

在1.2.2試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以葡萄糖濃度、牛肉膏濃度與培養(yǎng)溫度為自變量，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（表2），以菌絲體生物量為響應(yīng)值，對(duì)菌絲體生物量進(jìn)行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的回歸方程，根據(jù)試驗(yàn)生成的等高線和響應(yīng)面圖確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。

1.2.4 模型的驗(yàn)證

以發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳條件，比較模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值，驗(yàn)證模型的有效性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次，取平均值。從15組條件中選出一組最佳的培養(yǎng)工藝，對(duì)分析出來(lái)的最佳工藝條件模型再進(jìn)行4次重復(fù)試驗(yàn)，以驗(yàn)證響應(yīng)面分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和實(shí)際可行性，并與響應(yīng)面優(yōu)化前獲得的菌絲生物量進(jìn)行比較。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性檢測(cè)及方差分析（< 0.05），GraphPad Prism 5.0軟件繪圖，以Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Placket-Burman與Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析測(cè)試結(jié)果，以優(yōu)化因素的最佳添加量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同碳源與氮源的蛹蟲草菌絲生物量

在發(fā)酵液中添加不同碳源與氮源對(duì)蛹蟲草菌絲生物量的影響不同（圖1～圖3）。碳源以葡萄糖的菌絲體生物量顯著高于其他碳源，菌絲球密集，木糖的菌絲體生物量最低，菌絲球最少。氮源則以牛肉膏培養(yǎng)基蛹蟲草菌絲體生物量最高，菌絲球數(shù)量多而密集，以尿素為氮源的菌絲體生物量最低，幾乎不生長(zhǎng)。

2.1.2 不同pH與培養(yǎng)溫度的蛹蟲草生物量

隨著發(fā)酵液pH與培養(yǎng)溫度的升高，蛹蟲草菌絲體的生物量均呈先增加后下降的變化趨勢(shì)（圖4～圖6）。發(fā)酵液pH為6.5時(shí)，菌絲體生物量最高，為0.67 g/100 mL，pH 4和8的菌絲體生物量顯著低于其他處理。發(fā)酵液pH在5.5～7時(shí)，菌絲球大小基本一致，而pH偏低或偏高時(shí)，發(fā)酵液呈淡黃色，菌絲球小而數(shù)量少。

表1 Plackett-Burman分析因素及水平

表2 Box-Behnken分析因素及水平

注：小寫字母不同表示在P < 0.05水平差異顯著，下同。

圖2 不同氮源對(duì)蛹蟲草菌絲體生物量的影響

圖3 不同碳源與氮源蛹蟲草液體發(fā)酵情況

圖4 不同pH與培養(yǎng)溫度蛹蟲草液體發(fā)酵情況

培養(yǎng)溫度以27 ℃時(shí)，菌絲體生物量顯著高于其他處理，為0.6 g/100 mL，且菌絲生長(zhǎng)茁壯，幾乎覆蓋整個(gè)液面。當(dāng)培養(yǎng)溫度為19 ℃時(shí)，菌絲體生物量最低，為0.05 g/100 mL。

2.1.3 不同裝液量與培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的蛹蟲草生物量

不同裝液量與培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)蛹蟲草菌絲體的生物量有顯著影響，隨著裝液量與培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的增加，菌絲生物量均呈現(xiàn)先增加后下降的單峰曲線變化（圖7～圖9）。裝液量以105 mL菌絲體生物量顯著高于其他處理，菌絲球整體長(zhǎng)勢(shì)較好，均勻一致，培養(yǎng)液呈清亮的淡黃色。培養(yǎng)轉(zhuǎn)速以150 r/min菌絲生物量最高，為0.89 g/100 mL，顯著高于其他處理，當(dāng)轉(zhuǎn)速為110 r/min時(shí)，菌絲體生物量最低，僅為0.04 g/100 mL。

圖5 不同pH對(duì)蛹蟲草菌絲體生物量的影響

圖6 不同溫度對(duì)蛹蟲草菌絲體生物量的影響

圖7 不同裝液量對(duì)蛹蟲草菌絲體生物量的影響

圖8 不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)蛹蟲草菌絲體生物量的影響

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以菌絲體生物量為響應(yīng)值，以影響菌絲體生物量的葡萄糖、牛肉膏、溫度、pH、轉(zhuǎn)速、裝液量6個(gè)因素為考察因素，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，可知不同發(fā)酵液配方與發(fā)酵條件的組合對(duì)蛹蟲草菌絲體生物量的影響不同，菌絲體生物量從0.22 g到1.16 g不等。進(jìn)一步方差分析表明，葡萄糖（A）、牛肉膏（B）、溫度（C）3個(gè)因素對(duì)蛹蟲草菌絲體生物量具有顯著性影響（表4）。

圖9 不同裝液量與培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵的影響

2.3 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定葡萄糖、牛肉膏、溫度是影響蛹蟲草液體發(fā)酵菌絲體生物量的關(guān)鍵因素，以這3個(gè)因素為自變量，以生物量為響應(yīng)值，運(yùn)用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，結(jié)果見表5，菌絲體生物量在0.891～1.587 g/105 mL之間。用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到如下方程描述蛹蟲草菌絲體生物量的響應(yīng)面特征：

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Plackett-Burman方差分析結(jié)果

＝1.56＋0.14＋0.14－0.061－0.086＋0.009－0.062－0.1182－0.2092－0.1412

其中，是預(yù)測(cè)的菌絲體生物量，、、分別為葡萄糖、牛肉膏與培養(yǎng)溫度的編碼值。

回歸方程的方差分析表明，所建回歸方程的模型差異顯著（< 0.05），而失擬項(xiàng)差異不顯著（> 0.05），表明模型具有較高可靠性，建模成功。此外，葡萄糖、牛肉膏與培養(yǎng)溫度3個(gè)因素，以及、、2、2與2均顯著，模型的擬合度2為0.9841，表明該二次方程模型可以解釋和預(yù)測(cè)98.41%的變量響應(yīng)（表6）。

2.4 響應(yīng)曲面分析

葡萄糖、牛肉膏與培養(yǎng)溫度3個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)菌絲體生物量的響應(yīng)面曲面圖見圖10。響應(yīng)曲面圖越陡，因素之間的交互作用越顯著，反之不顯著；等高線越密集且形狀越近似于橢圓形，因素之間交互效應(yīng)越強(qiáng)，反之越弱[11]。由圖10可知，葡萄糖與牛肉膏、牛肉膏與培養(yǎng)溫度的交互作用顯著，而葡萄糖與培養(yǎng)溫度的交互作用不顯著。在等高線圖中，藍(lán)色區(qū)域?yàn)轫憫?yīng)最低值，紅色區(qū)域?yàn)轫憫?yīng)最高值。當(dāng)溫度為27 ℃時(shí)，葡萄糖濃度為20～23 g/L，牛肉膏濃度為12～14 g/L時(shí)蛹蟲草菌絲體生物量最高。牛肉膏濃度為12 g/L，當(dāng)葡萄糖濃度為20～23 g/L，溫度為26～27.5 ℃時(shí)蛹蟲草菌絲體生物量最高，其余區(qū)間干重較低不適合取值。當(dāng)葡萄糖濃度為20 g/L時(shí)，牛肉膏濃度為12～14 g/L，溫度為26～27.5 ℃為最佳取值區(qū)間，得到的蛹蟲草菌絲干重最高。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面模型數(shù)據(jù)分析得出愿望函數(shù)優(yōu)化，得到蛹蟲草最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏為13.34 g/L、葡萄糖20.0 g/L、MgSO41.5 g/L、KH2PO41.5 g/L，pH 6.5。最適培養(yǎng)條件為：溫度27 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，裝液量105 mL，發(fā)酵周期7 d。利用該參數(shù)再次進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，以檢驗(yàn)該模型的準(zhǔn)確性，4個(gè)平行試驗(yàn)結(jié)果得到菌絲體干重1.489 g，與預(yù)測(cè)值基本一致。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件試驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

注：2= 0.9841，2Adj= 0.9556；*與**分別表示差異顯著（<0.05）與極顯著（<0.01）。

3 討論與結(jié)論

蛹蟲草含有蟲草多糖、蟲草素、甾醇等生物活性物質(zhì)，具有降血糖、抗炎、抗腫瘤、抗轉(zhuǎn)移、降血脂、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等作用，食藥用價(jià)值高。優(yōu)化發(fā)酵配方與發(fā)酵條件是提高蛹蟲草液體發(fā)酵效率的重要途徑。本研究通過單因素試驗(yàn)明確了發(fā)酵液中的碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、pH、裝液量與培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)蛹蟲草菌絲體發(fā)酵的影響，并在此基礎(chǔ)上利用Plackett-Burman與Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，分析了因素間的交互作用。結(jié)果顯示葡萄糖與牛肉膏分別是發(fā)酵液的最優(yōu)碳源與氮源。此前，也有研究表明葡萄糖是蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)與蟲草素合成的重要前體，這與本研究的結(jié)果一致[12]。本研究氮源試驗(yàn)表明牛肉膏、蛋白胨與酵母膏等有機(jī)氮源均利于蛹蟲草菌絲體的生長(zhǎng)，而無(wú)機(jī)氮的尿素則不利于菌絲的生長(zhǎng)，這與Mao等[13]的研究結(jié)果相近。響應(yīng)面分析表明葡萄糖與牛肉膏2個(gè)因素之間存在顯著的交互作用，因此在考慮碳源與氮源用量時(shí)應(yīng)該綜合考慮。

本研究顯示蛹蟲草菌絲體在弱酸性環(huán)境中（pH 5.5～6.5）生長(zhǎng)良好，這與Sung等[14]以及Park等[15]的研究結(jié)果相近。培養(yǎng)轉(zhuǎn)速與裝液量均關(guān)系到發(fā)酵液中的溶氧量，而適宜的溶氧量有利于菌絲體的生長(zhǎng)和代謝平衡。本研究蛹蟲草菌絲體液體培養(yǎng)最佳裝液量為105 mL，最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min，這與劉然等的研究結(jié)果接近[16]。

綜上所述，本研究獲得的蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵的最佳配方及條件為：牛肉膏13.34 g/L、葡萄糖20.00 g/L、MgSO41.5 g/L、KH2PO41.5 g/L，pH為6.5，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度27.08 ℃（為便于操作，使用27 ℃）。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，優(yōu)化后的菌絲生物量可達(dá)1.489 g/105 mL，是優(yōu)化前的2倍，與模型預(yù)測(cè)值基本一致，優(yōu)化效果較好，為蛹蟲草液體深層發(fā)酵培養(yǎng)及后續(xù)工廠化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考和理論依據(jù)。

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Optimization of formula and conditions for liquid fermentation ofby response surface method

TONG Qiwei1ZHOU Jiliang2LUO Shanshan2CAO Tianxu2JIANG Jiaying2DU Ping2*

（1. College of Biology and Food Enginerring, Chongqing Three Gorges University, Wanzhou 404100, China；2. College of Modern Agriculture and Bioengineering, Yangtze Normal University, Fuling 408100, China）

is a kind of rare medicinal and edible mushroom. In order to improve the liquid fermentation efficiency of its mycelia, the optimum carbon source, nitrogen source, pH, temperature, volume of culture media and rotation speed for liquid fermentation were optimized by single factor test. Then Plackett-Burman method was used to further optimize the single factors that were screened to affect mycelia biomass to screen the key influencing factors. The optimal formula and conditions of liquid fermentation ofmycelia were obtained as follows: beef extract 13.34 g/L, glucose 20.00 g/L, MgSO41.5 g/L, KH2PO41.5 g/L, pH 6.5, shaking speed 150 r/min, temperature 27 ℃. Verification tests showed that the biomass of mycelia under optimized conditionscould reach 1.489 g/105 mL, which was twice that before optimization, basically consistent with the predicted value of the model, and the optimization effect was good, which provided a theoretical basis for liquid deep fermentation culture and subsequent factory production of.

; liquid fermentation; response surface method; mycelial biomass

S646

A

2095-0934（2024）01-052-08

全國(guó)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（X202310647090）；長(zhǎng)江師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（X202310647090）

童奇?zhèn)ィ?998—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭乘幱镁Y源及馴化栽培研究。E-mail：1694180435@qq.com

杜萍（1982—），女，博士，教授，主要從事食藥用菌資源、馴化栽培及分子系統(tǒng)學(xué)研究。E-mail：duping7374@163.com。