潘春陽，李鑫，蘇文悅，胡俊玲，魯曉曉，潘峰，張晨，張輝，黃澤軍，國艷梅，王孝宣，杜永臣，劉磊，李君明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

卵菌綱致病疫霉（Phytophthorainfestans）引起的晚疫病是危害番茄生產(chǎn)的毀滅性病害，其生理小種進(jìn)化快、致病力強(qiáng)、化學(xué)防治難有成效，培育抗性品種是實(shí)現(xiàn)晚疫病防治的有效措施（Foolad et al.，2008；Li et al.，2011）。

目前，抗番茄晚疫病最有效的基因是Ph-2與Ph-3，聚合二者可抗多個(gè)生理小種，在抗性品種培育中應(yīng)用最為廣泛（Zhi et al.，2021）。但研究表明Ph-2和Ph-3基因均存在株齡相關(guān)抗性（age-related resistance，ARR），轉(zhuǎn)入Ph-2和Ph-3基因的抗病材料三葉期幼苗接種致病疫霉后表現(xiàn)為一定程度的感病，其抗性隨著株齡增加而逐漸增強(qiáng)，并在六葉期后充分表達(dá)（Chungwongse et al.，2002；李君明等，2007；李濤 等，2015）。

株齡相關(guān)抗性通常指植物的某種抗性隨苗齡增長而出現(xiàn)增強(qiáng)或降低的現(xiàn)象，是植物對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌、卵菌、昆蟲等抗性適應(yīng)性的一種普遍現(xiàn)象（Hu & Yang，2019），在合適的株齡，植物激活更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，既可以增加對(duì)病原的抗性，又能減少其他時(shí)期不必要的免疫激活而造成的負(fù)面影響，但這同時(shí)意味著在株齡更小時(shí)期，抗性品種幼苗仍然面臨著病原侵染的威脅。前人研究發(fā)現(xiàn)許多開花植物的植株抗病性與其株齡正相關(guān)，并通過對(duì)擬南芥、蘋果、草莓和黃瓜等轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)這種抗性可能是由物理屏障、化學(xué)防御和先天免疫等協(xié)同組成，并涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控（Gusberti et al.，2013；Ando et al.，2015；Mansfeld et al.，2017；Zou et al.，2018；Hu & Yang，2019）。盡管目前對(duì)株齡相關(guān)抗性機(jī)制已經(jīng)有了初步認(rèn)識(shí)，但尚未有在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)番茄-晚疫病互作中株齡相關(guān)抗性分析的報(bào)道。

本研究通過對(duì)Ph-2晚疫病抗性材料三葉期與六葉期幼苗接種后不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析，對(duì)可能調(diào)控其株齡抗性的基因進(jìn)行了初步篩選，并對(duì)水楊酸與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路響應(yīng)晚疫病抗性的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，以期為揭示番茄晚疫病株齡抗性相關(guān)機(jī)制提供理論依據(jù)，為培育晚疫病持久抗性番茄品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用Ph-2晚疫病抗性材料是以Heinz1706為背景的近等基因系，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所番茄遺傳育種課題組構(gòu)建，2020 年5 月分批播種，第1 批播種后10 d 進(jìn)行第2 批播種，幼苗定植于本所北圃場溫室，待第1 批播種幼苗第6片真葉充分展開，第2 批播種幼苗第3 片真葉充分展開、第4 片真葉剛剛長出時(shí)，選取長勢相近、一致性好的幼苗進(jìn)行接種鑒定。致病疫霉T0，1生理小種由本所植保室提供。

1.2 接種鑒定

參照李濤等（2015）的接種鑒定方法，對(duì)Ph-2晚疫病抗性材料三葉期與六葉期幼苗各20 株進(jìn)行接種鑒定。

1.3 樣品RNA 的提取、建庫測序與分析

接種后0、8、24、48 h 分別取三葉期幼苗第3 片真葉，六葉期幼苗第6 片真葉，使用華越洋Quick Total RNA Isolation Kit 提取試劑盒提取RNA，每個(gè)樣品設(shè)置2 次生物學(xué)重復(fù)，建庫測序與分析由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.4 qRT-PCR 驗(yàn)證

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，使用諾唯贊HiScriptⅡ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行測序RNA 樣品的反轉(zhuǎn)錄。采用 SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa，USA）進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，以番茄Actin基因作為內(nèi)參基因，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3 次重復(fù)，使用2-ΔΔCT方法分析結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2016 軟件整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS 24 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，使用GraphPad Prism 8 對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄Ph-2 基因不同株齡的晚疫病抗性鑒定

番茄晚疫病病原菌接種后表型鑒定的時(shí)間一般為7 d 左右，本試驗(yàn)所用的病原菌生理小種致病力較弱，因此接種后8 d 進(jìn)行表型鑒定，結(jié)果如表1 所示，Ph-2抗性材料三葉期幼苗病級(jí)指數(shù)5.30 ±0.66，六葉期幼苗病級(jí)指數(shù)2.30 ± 0.94，存在極顯著性差異（P＜0.01），表明Ph-2基因存在株齡相關(guān)抗性。

表1 番茄Ph-2 晚疫病抗性材料三葉期與六葉期幼苗接種后表型鑒定結(jié)果

2.2 番茄Ph-2 基因不同株齡晚疫病抗性的轉(zhuǎn)錄組測序

對(duì)三葉期幼苗與六葉期幼苗接種后0、8、24、48 h 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)共計(jì)16 個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得98.12 Gb Clean Data。各樣品的Clean Data Q30 堿基百分比均不小于92.38%。分別將各樣品的Clean reads 與番茄Heinz1706 參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，各樣品的reads 比對(duì)效率在87.79%～97.07%之間，各重復(fù)間相關(guān)性均高于0.8，以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可用于下一步分析。

2.3 番茄Ph-2 基因晚疫病株齡相關(guān)抗性基因的篩選

由圖1 可知，對(duì)0 hpi（hpi 為接種后時(shí)間，單位：小時(shí)）與48 hpi 三葉期幼苗與六葉期幼苗差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析，均能富集到“植物-病原互作”中的相關(guān)基因，表明在病原侵染前與侵染完成后，三葉期幼苗與六葉期幼苗抗性存在一定差異。

圖1 三葉期幼苗與六葉期幼苗在接種后0 h（A）和48 h（B）差異表達(dá)基因KEGG 富集分析

為了探究Ph-2晚疫病抗性材料出現(xiàn)株齡相關(guān)抗性是否為Ph-2基因在不同株齡幼苗中差異表達(dá)所致，對(duì)不同株齡材料在4 個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選（Fold change ≥2，F(xiàn)DR ≤0.01，表達(dá)量單位：FPKM）。分析發(fā)現(xiàn)（表2），Ph-2基因精細(xì)定位區(qū)間中所有基因在兩組材料中均不存在表達(dá)差異，因此推斷Ph-2株齡相關(guān)抗性并非由Ph-2基因在不同材料中差異表達(dá)引起。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在差異表達(dá)的基因中也不包括NBS-LRR、STK等其他典型抗病基因，降低差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)（Fold change ≥1.5，F(xiàn)DR ≤0.05）后仍得到相同的結(jié)果。因此，推斷本試驗(yàn)中Ph-2抗性材料出現(xiàn)株齡相關(guān)抗性并不是由抗病基因差異表達(dá)直接導(dǎo)致。

表2 不同樣品組間差異表達(dá)基因情況

進(jìn)一步對(duì)三葉期幼苗和六葉期幼苗在0～48 hpi 與8～48 hpi 間均存在差異表達(dá)的基因進(jìn)行分析（表3），在0～48 hpi 間篩選到1 個(gè)在六葉期幼苗中表達(dá)量始終顯著高于三葉期幼苗基因Solyc01g006290，該基因編碼過氧化物酶活性蛋白，可進(jìn)行細(xì)胞氧化解毒，并參與調(diào)控木質(zhì)素合成。木質(zhì)素是細(xì)胞壁修飾的重要組成部分，在植物抗病性中起著重要作用（Passardi et al.，2010）。同時(shí)過氧化物酶活性基因在植物細(xì)胞壁受到破壞時(shí)還可以作為信號(hào)物質(zhì)激活下游免疫反應(yīng)，如疫霉侵染辣椒后，辣椒過氧化物酶活性基因的表達(dá)與植株抗性正相關(guān)（Alcázar et al.，2010）。在8～48 hpi 間的差異表達(dá)基因中同樣篩到六葉期幼苗表達(dá)量顯著高于三葉期幼苗的過氧化物酶活性基因Solyc02g087110。此外，還篩選到3 個(gè)未知蛋白，其表達(dá)量在六葉期幼苗與三葉期幼苗中存在顯著性差異。如圖2 所示，試驗(yàn)進(jìn)一步通過qRT-PCR 驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果。

圖2 株齡抗性相關(guān)基因在不同時(shí)期幼苗中的表達(dá)量

表3 株齡抗性相關(guān)基因的篩選 單位：FPKM

由于過氧化物酶活性基因在植物細(xì)胞壁建成與修復(fù)中起關(guān)鍵作用，因此進(jìn)一步篩選了六葉期幼苗較之三葉期幼苗差異表達(dá)基因中與細(xì)胞壁相關(guān)的基因。結(jié)果在0、8、24 hpi 和48 hpi 中分別篩選到178 個(gè)（125 個(gè)表達(dá)量顯著上調(diào)，53 個(gè)顯著下調(diào)）、120 個(gè)（45 個(gè)顯著上調(diào)，75 個(gè)顯著下調(diào)）、9 個(gè)（5個(gè)顯著上調(diào)，4 個(gè)顯著下調(diào)）、225 個(gè)（171 個(gè)顯著上調(diào)，54 個(gè)顯著下調(diào)）與細(xì)胞壁相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中六葉期幼苗表達(dá)量顯著高于三葉期幼苗的基因大多與細(xì)胞壁的生物發(fā)生和修飾有關(guān)，少數(shù)表達(dá)量低于三葉期幼苗的基因與細(xì)胞壁分解等相關(guān)。

2.4 番茄Ph-2 基因不同株齡水楊酸與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中免疫響應(yīng)基因的分析

水楊酸與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)基因介導(dǎo)了番茄對(duì)晚疫病的抗性反應(yīng)（Eschen-Lippold et al.，2010）。通過對(duì)接種后水楊酸與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路差異表達(dá)基因分析（Fold change ≥2，F(xiàn)DR ≤0.01，表達(dá)量單位：FPKM）表明，三葉期與六葉期幼苗接種后水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中17 個(gè)基因差異顯著，其中多數(shù)基因表達(dá)趨勢在2 種材料中較為一致，而Solyc01g106620、Solyc09g006005、Solyc09g007010、Solyc11g068370和SLnewgene3379共5 個(gè)基因在三葉期幼苗中表達(dá)量明顯高于六葉期幼苗（表4）；乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中9 個(gè)基因差異顯著，其中6 個(gè)基因在2 種材料中的表達(dá)模式與表達(dá)量較為相近，Solyc09g089930、Solyc07g008250、Solyc01g009170共3 個(gè)基因在兩種材料間表達(dá)趨勢不一致且表達(dá)量差異較大（表5），這可能與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)。

表4 水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中差異表達(dá)基因單位：FPKM

表5 乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中差異表達(dá)基因 單位：FPKM

3 結(jié)論與討論

株齡相關(guān)抗性是植物中普遍存在的一種防御機(jī)制，它在一定程度上協(xié)調(diào)了生長發(fā)育與抗性反應(yīng)之間的平衡，揭示株齡相關(guān)抗性機(jī)制是實(shí)現(xiàn)作物持久抗性的關(guān)鍵，也是作物育種的重要目標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)過氧化物酶活性基因Solyc01g006290和Solyc02g087110在不同株齡番茄幼苗葉片中的表達(dá)差異可能是番茄抗晚疫病Ph-2基因株齡相關(guān)抗性產(chǎn)生的原因之一。

過氧化物酶活性基因在植物抗病中發(fā)揮重要作用。辣椒中CaPO2的異源表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥的抗病性，引起HR 反應(yīng)、H2O2積累和病原體相關(guān)（PR）基因的表達(dá)（Choi，2007）。水稻中OsPrx114的異源表達(dá)也能夠誘導(dǎo)PR 基因的表達(dá)并增強(qiáng)對(duì)病原體的抗性（Wally & Pnuja，2010）。研究表明，在病原菌侵染初期，過氧化物酶基因的表達(dá)與抗性正相關(guān)，抗性物種在這一時(shí)期會(huì)迅速反應(yīng)并產(chǎn)生大量的過氧化物酶，感病物種則出現(xiàn)反應(yīng)滯后或不產(chǎn)生過氧化物酶的情況（蔣選利 等，2001），這與本試驗(yàn)中過氧化物酶基因Solyc02g087110的表達(dá)類似，其0 hpi的表達(dá)量在六葉期幼苗與三葉期幼苗中不存在顯著性差異，在8 hpi 時(shí)受到病原侵染表達(dá)量均出現(xiàn)一定的下調(diào)，但六葉期幼苗中該基因下調(diào)幅度較小且表達(dá)水平顯著高于三葉期幼苗，而后其表達(dá)量迅速恢復(fù)并持續(xù)高水平表達(dá)，但在三葉期幼苗中，該基因的下調(diào)幅度明顯更大，并在8～48 hpi 間持續(xù)低水平表達(dá)。另外，細(xì)胞壁相關(guān)過氧化物酶在植株受到外傷、病原等外部作用后能夠催化木質(zhì)素或木栓素等物理屏障的形成，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞壁硬化，從而限制病原物的入侵（Passardi et al.，2010）。本試驗(yàn)中篩選到的另一個(gè)過氧化物酶基因Solyc01g006290位于木質(zhì)素合成通路，正調(diào)控木質(zhì)素合成。其在三葉期幼苗與六葉期幼苗中的表達(dá)差異可能影響受損細(xì)胞壁的修復(fù)效率與硬化程度，造成細(xì)胞壁強(qiáng)度差異，進(jìn)而導(dǎo)致株齡相關(guān)抗性的產(chǎn)生。通過對(duì)六葉期幼苗與三葉期幼苗差異表達(dá)基因中細(xì)胞壁相關(guān)基因的分析結(jié)果也與此推斷基本一致。

此外，前人研究表明水楊酸與乙烯介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在番茄晚疫病抗性中起重要作用（李濤等，2015），本試驗(yàn)對(duì)接種致病疫霉后水楊酸與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)六葉期幼苗與三葉期幼苗中相關(guān)基因的表達(dá)趨勢基本一致，但部分基因的表達(dá)模式與表達(dá)量存在較大差異，這些差異可能在一定程度上影響到抗性激活的時(shí)間與強(qiáng)度。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，植物株齡相關(guān)抗性可能不是由典型抗病基因在不同株齡植株中差異表達(dá)直接引起的，其可能是由過氧化物酶活性基因、細(xì)胞壁修復(fù)與強(qiáng)化、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等先天免疫組分在不同株齡材料中差異表達(dá)導(dǎo)致。但株齡相關(guān)抗性是由內(nèi)在的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其表達(dá)模式涉及環(huán)境條件、植物生理狀態(tài)和病原體周期之間復(fù)雜的相互作用，并由物理屏障、化學(xué)免疫和先天防御協(xié)同組成，株齡抗性的互作不僅限于基因與基因間，在基因與miRNA 間也存在復(fù)雜的相互作用（Shubin &Dahn，2004；Zhang et al.，2011；Ando et al.，2015；Mansfeld et al.，2017；Luan et al.，2018；Zou et al.，2018）。因此，揭示株齡相關(guān)抗性機(jī)制需要借助多組學(xué)技術(shù)綜合分析，進(jìn)而加快株齡抗性關(guān)鍵基因的鑒定，解析其時(shí)空表達(dá)特性，以期借助基因編輯等手段改變相關(guān)基因特定時(shí)期的表達(dá)模式或提前激活株齡相關(guān)抗性的“基因開關(guān)”，從而創(chuàng)制出具有持久抗性的新種質(zhì)。