甄慶強(qiáng)，朱冬霞，劉永昌，孫 巖

頸動(dòng)脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis, CAS）是指頸動(dòng)脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積導(dǎo)致動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄、血管彈性減退的血管疾病[1]。CAS 是導(dǎo)致缺血性腦卒中的病因之一，也是影響患者卒中后認(rèn)知功能的因素[2]。來自中國臺(tái)灣省的10 年隨訪研究表明，CAS 病變程度可以預(yù)測患者的認(rèn)知能力[3]。降脂、穩(wěn)定斑塊、血管緊張素受體拮抗劑等藥物是目前治療CAS 的一線藥物[4-5]，但治療效果和藥物依從性不盡如人意。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥瓜蔞皮提取物可降低同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠的血清Hcy 水平，抑制動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖速度[6]，但瓜蔞皮提取物對(duì)高Hcy 頸動(dòng)脈粥樣硬化的治療效果尚不明確。本研究擬通過觀察他汀類藥物聯(lián)合瓜蔞皮注射液治療高Hcy 頸動(dòng)脈粥樣硬化的效果，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)思路挖掘瓜蔞皮注射液治療CAS 的潛在機(jī)制，并設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，為CAS 的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床研究

1.1.1 研究對(duì)象 選取2019 年1 月—2021 年1 月于濟(jì)南市人民醫(yī)院住院治療的高Hcy 頸動(dòng)脈粥樣硬化患者120 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合頸動(dòng)脈粥樣硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)，頸動(dòng)脈狹窄率≤50%[7-8]；2）Hcy 水平>10 μmol/L[9]；3）能配合本研究并完成隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）服用葉酸、維生素B6 及維生素B12 等降低血清Hcy 水平的藥物；2）頸動(dòng)脈粥樣硬化伴重度狹窄需要手術(shù)干預(yù)或近3 個(gè)月內(nèi)接受頸動(dòng)脈手術(shù)者；3）嚴(yán)重肝腎功能不全者；4）合并急性心腦血管意外或惡性腫瘤者。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：濟(jì)醫(yī)倫批SWYX:No.2019-002）。采用隨機(jī)數(shù)字表法將本組患者分為觀察組和對(duì)照組，每組60例。兩組患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、病程、合并糖尿病、合并冠心病、合并高血壓人數(shù)、使用他汀類藥物類別及他汀藥物劑量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表1）。

表1 兩組患者基線資料比較

1.1.2 治療方案 對(duì)照組患者給予基礎(chǔ)治療：應(yīng)用他汀類藥物穩(wěn)定斑塊；應(yīng)用抗血小板聚集藥物抑制血小板聚集。觀察組在基礎(chǔ)治療基礎(chǔ)上，給予瓜蔞皮注射液（國藥準(zhǔn)字Z20027540）治療，8 mL 加入5%葡萄糖注射液250 mL 中靜脈滴注，1 次/d，治療周期為3 周。

1.1.3 觀察指標(biāo) 1）檢測兩組患者治療前后總膽固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、Hcy 水平；2）采用雙側(cè)頸動(dòng)脈各測量3 次取平均值的方法，使用彩色多普勒超聲儀測量頸總動(dòng)脈頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（intima mesosphere thickness, IMT）。

1.2 實(shí)驗(yàn)研究

1.2.1 瓜蔞皮干預(yù)CAS 的靶點(diǎn)篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)檢索瓜蔞皮的有效成分，參照既往文獻(xiàn)，將符合藥物口服生物利用度和藥物相似度類藥比的成分納入研究[10]。登錄高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus, GEO），下載包含CAS 基因數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集GSE100927，利用R 軟件limma 數(shù)據(jù)包[11]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得差異表達(dá)基因。將瓜蔞皮作用靶點(diǎn)與CAS 差異表達(dá)基因取交集，獲取瓜蔞皮干預(yù)CAS 的靶點(diǎn)。

1.2.2 瓜蔞皮干預(yù)CAS“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 使用Cytoscape 3.9.2 軟件繪制瓜蔞皮干預(yù)CAS 的“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)。使用STRING 平臺(tái)[12]和Cytoscape 3.9.2 軟件繪制瓜蔞皮干預(yù)CAS 靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用（proteinprotein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)，以cytoHubba 插件[13]中節(jié)點(diǎn)度值（degree）為標(biāo)準(zhǔn)，篩選瓜蔞皮干預(yù)CAS 的關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只6 周齡無特殊病原體（specific pathogen free, SPF）級(jí)SD 雄性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[合格證號(hào)：370726231100053607，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20220006]。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房（室溫23～25 ℃、相對(duì)濕度7%），自由飲水、攝食。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔多克隆抗體核因子（NF）-κB p65、兔多克隆抗體腫瘤壞死因子（TNF）-α、兔多克隆抗體基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、兔多克隆抗體血管細(xì)胞黏附因子-1(VCAM-1）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：AI00133231、AI10202348、AH27187919、AB12157553）；SABC 免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：SA1142）；蛋白濃度測定試劑盒（美國AMERSHAM 公司，批號(hào)：RPN2232）；水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：R21454）。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模方法 將30 只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和治療組，每組10 只，分籠飼養(yǎng)。參照代淵等[14]、靳宏光等[15]造模方法復(fù)制高同型半胱氨酸血癥動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型：1.5%蛋氨酸水溶液按照10 mL/kg 體重灌胃，2 次/d；同時(shí)給予高糖高脂飼料（南京協(xié)同生物）喂養(yǎng)2 周后，按照3 mL/kg 體重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，游離并顯露腹主動(dòng)脈，于主髂動(dòng)脈分叉處穿刺，置入球囊，上行至腎動(dòng)脈水平以上，調(diào)節(jié)壓力泵壓力至6～8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，緩慢抽動(dòng)球囊3 次，撤出球囊，用7-0無損傷尼龍線縫合穿刺點(diǎn)，檢查無出血后，逐層縫合關(guān)閉腹腔。術(shù)后即刻給予青霉素10 萬單位皮下注射、術(shù)后3 d 內(nèi)每天給予青霉素10 萬單位預(yù)防感染。6 周后，模型組和治療組各隨機(jī)選1 只大鼠，自尾靜脈取血，檢測Hcy 水平，水合氯醛麻醉后取腹主動(dòng)脈，石蠟包埋、切片、鏡下觀察。Hcy ＞15 μmol/L，主動(dòng)脈內(nèi)膜欠光滑，平滑肌排列紊亂、增生，視為造模成功（圖1）。根據(jù)人與動(dòng)物的每公斤體重劑量折算系數(shù)，計(jì)算得到大鼠瓜蔞皮注射液給藥劑量為0.83 mL/kg，生理鹽水給藥劑量為10 mL/kg。以上述給藥劑量為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組和模型組大鼠每天自尾靜脈注射相應(yīng)劑量的生理鹽水，治療組大鼠每天自尾靜脈注射相應(yīng)劑量的瓜蔞皮注射液，1 次/d，連續(xù)給藥7 d。

圖1 大鼠主動(dòng)脈HE 染色結(jié)果（×400）

1.3.4 指標(biāo)檢測 1）取材：給藥7 d 后，麻醉3 組大鼠，將腹主動(dòng)脈取出并均分為兩份，分別保存于4%多聚甲醛和液氮中；頸椎脫臼處死大鼠。2）免疫組化法檢測大鼠腹主動(dòng)脈NF-κB p65、TNF-α、MMP-9 和VCAM-1 蛋白水平：采用Image J 軟件進(jìn)行平均積分光密度（optical density, OD）值分析。3）蛋白免疫印跡（Western Blot）法測定大鼠腹主動(dòng)脈中NF-κB p65、TNF-α、MMP-9、VCAM-1 蛋白水平，使用Image J 進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，前后比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較及前后比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床研究

2.1.1 兩組患者血脂水平比較 治療前，兩組患者TC、TG、LDL-C 和Hcy 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后，對(duì)照組患者TC 水平較治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；TG、LDL-C 和Hcy 水平較治療前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；觀察組患者TC、TG、LDL-C 和Hcy 水平較治療前下降，且低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表2）。

表2 兩組患者血脂水平比較

2.1.2 兩組患者IMT 比較 治療前，兩組患者IMT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后，觀察組和對(duì)照組患者IMT 較治療前均下降，且觀察組患者IMT 水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表3）。

表3 兩組患者IMT 比較（mm）

2.2 實(shí)驗(yàn)研究

2.2.1 瓜蔞皮干預(yù)CAS 的靶點(diǎn)篩選 獲得瓜蔞皮有效成分11 個(gè)，靶點(diǎn)422 個(gè)。獲得CAS 相關(guān)差異表達(dá)上調(diào)基因1248 個(gè)，差異表達(dá)下調(diào)基因887 個(gè)，繪制火山圖和熱圖進(jìn)行可視化。將瓜蔞皮作用靶點(diǎn)與CAS 差異表達(dá)基因取交集，獲取瓜蔞皮干預(yù)CAS 的靶點(diǎn)61 個(gè)，其中差異表達(dá)上調(diào)基因38 個(gè)，差異表達(dá)下調(diào)基因23 個(gè)（表4，圖2）。

圖2 瓜蔞皮干預(yù)CAS 的靶點(diǎn)篩選

表4 瓜蔞皮干預(yù)CAS 的靶點(diǎn)

2.2.2 瓜蔞皮干預(yù)CAS“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 使用Cytoscape 3.9.2 軟件構(gòu)建瓜蔞皮干預(yù)CAS“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，以節(jié)點(diǎn)度值為條件篩選瓜蔞皮干預(yù)CAS 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。富集分析結(jié)果表明，瓜蔞皮干預(yù)CAS 的關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集在TNF 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等通路上（圖3）。

圖3 瓜蔞皮干預(yù)CAS"藥物- 靶點(diǎn)- 疾病"網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

2.3 大鼠腹主動(dòng)脈TNF-α、NF-κB p65、VCAM-1、MMP-9 表達(dá)量測定

2.3.1 免疫組化結(jié)果 模型組和治療組大鼠腹主動(dòng)脈TNF-α、MMP-9 表達(dá)均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療組和空白組NF-κB p65、VCAM-1 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型組相比，治療組TNF-α、NF-κB、VCAM-1、MMP-9 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖4）。

圖4 瓜蔞皮注射液對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈各指標(biāo)蛋白表達(dá)的影響

2.3.2 Western Blot 法檢測結(jié)果 模型組和治療組腹主動(dòng)脈TNF-α、MMP-9 蛋白表達(dá)量均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療組和空白組NF-κB p65、VCAM-1 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型組相比，治療組TNF-α、NF-κB、VCAM-1、MMP-9 表達(dá)量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖5）。

圖5 瓜蔞皮注射液對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈各指標(biāo)蛋白表達(dá)的影響（Western Blot 法）

3 討論

瓜蔞皮是葫蘆科植物栝樓（雙邊栝樓）的果皮，其功效主要包括清化熱痰、寬胸散結(jié)等[16]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，瓜蔞皮富含木犀草素等黃酮類化合物、蘇氨酸等氨基酸、β-谷甾醇等甾醇以及大量揮發(fā)油[17]，其提取液可通過抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等途徑治療心血管疾病[18]。劉思妤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，瓜蔞皮乙醇提取物能顯著減少人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)活性氧、TNF-α 和白細(xì)胞介素-6等促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平，發(fā)揮抗炎、抗氧化作用。楊震等[20]研究證實(shí)，瓜蔞皮可降低高血脂合并急性心肌缺血模型大鼠超氧化物歧化酶、脂質(zhì)過氧化物、過氧化氫酶、總抗氧化能力和氧化型低密度脂蛋白水平，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)心血管。

既往研究證實(shí)，高膽固醇血癥、高LDL-C 水平、高Hcy 水平與頸動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[21-23]。頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度是CAS 嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，Hcy水平與頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度及斑塊形態(tài)和面積線性相關(guān)[23-25]。本研究結(jié)果表明，他汀類藥物可降低合并高Hcy 的CAS 患者TG、LDL-C、Hcy 水平。聯(lián)合應(yīng)用瓜蔞皮提取物，可顯著降低CAS 伴高Hcy 血癥患者TC、TG、LDL-C 和Hcy 水平，治療效果優(yōu)于單用他汀類藥物。表明瓜蔞皮提取物可通過調(diào)節(jié)血脂和Hcy 水平等途徑改善CAS。同時(shí)，他汀類藥物聯(lián)合應(yīng)用瓜蔞皮提取物可減小頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度，延緩CAS 進(jìn)展。

本研究通過生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路挖掘了瓜蔞皮干預(yù)CAS 的潛在機(jī)制，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。結(jié)果提示，瓜蔞皮干預(yù)CAS 的關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集在TNF/NF-κB 信號(hào)通路上。炎性反應(yīng)貫穿動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程。單核細(xì)胞等炎性相關(guān)細(xì)胞通過TNF-α、白細(xì)胞介素-6 等因子參與活性氧簇介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，并向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化[26]；斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，當(dāng)脂質(zhì)累積過多超過巨噬細(xì)胞的處理能力時(shí)，巨噬細(xì)胞泡沫化，形成泡沫細(xì)胞[27]；斑塊內(nèi)活化的炎癥細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)和斑塊的纖維帽，降低斑塊的穩(wěn)定性，增加其破裂的幾率[28-29]。TNF/NF-κB 信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥反應(yīng)通路。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠腹主動(dòng)脈組織TNF-α、NF-κB p65、VCAM-1、MMP-9 表達(dá)顯著上調(diào)，瓜蔞皮注射液可抑制上述指標(biāo)的表達(dá)，提示其可以通過抑制TNF/NF-κB 信號(hào)通路的激活發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。