張 棟，馮麗莉，荀一萍，薛玉玲，寧一冰，王世杰

（君樂寶乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司 石家莊 050221）

雙歧桿菌由法國巴斯德研究所的Tissier 于1900 年從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中首次分離得到[1]。隨著研究的深入，雙歧桿菌已成為眾所周知的一類益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群[2-4]、抗腫瘤[5-7]、降膽固醇[8-9]以及延緩衰老[10-11]等功能性。另外，雙歧桿菌已成為評(píng)價(jià)腸道菌群健康的重要參考指標(biāo)。尤其在生命早期的嬰兒腸道菌群中，雙歧桿菌的種類和相對(duì)豐度對(duì)嬰兒健康和后期成長都有重要作用[12-13]。在益生菌開發(fā)中，一般認(rèn)為健康人體，特別是健康嬰兒腸道樣本是理想的益生菌來源。日本科學(xué)家就根據(jù)其不同寄宿環(huán)境將雙歧桿菌分為人類親和型雙歧桿菌（Human-residential bifidobacteria，HRB）和非人類親和型雙歧桿菌（Nonhuman-residential bifidobacteria，NHRB）[14]。常見的HRB 包括長雙歧桿菌長亞種（Bifidobacterium longum subsp.longum）、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）、長雙歧桿菌嬰兒亞種（Bifidobacterium longum subsp.infantis）、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）。研究表明HRB 由于能夠更好地利用母乳低聚糖并耐受溶菌酶，因此HRB 具有更好的腸道定植能力，是更適合人體尤其是嬰幼兒的益生菌[15-18]。

我國對(duì)于雙歧桿菌的研究和開發(fā)較晚。市售益生菌酸奶中的雙歧桿菌以歐美和日本廠商開發(fā)的少數(shù)幾種菌株為主，限制了益生菌酸奶產(chǎn)品開發(fā)的多樣性，也無法滿足消費(fèi)者對(duì)于益生菌酸奶的需求。

本試驗(yàn)從健康嬰兒糞便樣品中分離得到1 株疑似雙歧桿菌，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，研究其消化液耐受能力、免疫調(diào)節(jié)作用以及發(fā)酵特性，以期為我國益生菌發(fā)酵乳提供優(yōu)良的雙歧桿菌，為我國自有雙歧桿菌的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

嬰幼兒糞便：君樂寶乳業(yè)集團(tuán)收集的健康順產(chǎn)嬰兒新鮮糞便樣品，于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試劑與儀器

API50 試劑盒，法國梅里埃；莫匹羅星鋰鹽配套試劑、天根細(xì)菌DNA 提取試劑盒、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉等均為生物純級(jí)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葡萄糖、KH2PO4等均為分析純級(jí)，石家莊現(xiàn)代儀器儀表化工有限公司；脫脂乳粉，雀巢（中國）有限公司；THP-1 細(xì)胞、細(xì)胞總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 及電泳所用試劑，河北本源生物科技有限公司；生牛乳，君樂寶乳業(yè)集團(tuán)。酸奶發(fā)酵劑JLB-1510，河北一然生物科技有限公司。

人工胃液：NaCl 0.2 g/100 mL、胃蛋白酶（Pepsin）0.35 g/100 mL，用濃度為1 mol/L 的HCl調(diào)整pH 值為3.0 后，過濾除菌，備用。人工腸液：將下述a 液和b 液以體積比2∶1 混合即為人工腸液。a.胰腺液：重碳酸鈉1.1 g/100 mL，NaCl 0.2 g/100 mL，胰蛋白酶（Trypsin）0.1 g/100 mL，調(diào)整pH值為8.0，過濾除菌，備用。b.膽汁液：Bile Salts（Difco）0.9 g/100 mL，調(diào)整pH 值為8.0，過濾除菌，備用。

生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CML51 生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司；凈化工作臺(tái)、高速離心機(jī)、熒光定量PCR 儀，賽默飛世爾科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，日本雅瑪拓公司。

1.3 培養(yǎng)基

改良固體MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 mL/L，乙酸鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.25 g/L，L-半胱氨酸0.5 g/L，瓊脂15.0 g/L，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.5。倒平板前每100 mL 培養(yǎng)基加入1 支莫匹羅星鋰。

改良液體MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 mL/L，乙酸鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.25 g/L，L-半胱氨酸0.5 g/L，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.5。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 雙歧桿菌的分離、純化和保存 取備用糞便樣品1 g 至9 mL 無菌生理鹽水中，振蕩混勻后，繼續(xù)使用無菌生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋。取不同稀釋梯度稀釋液100 mL 至提前準(zhǔn)備好的改良MRS 固體培養(yǎng)基平板，涂布。將涂布好的平板置于厭氧罐，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。觀察平板長出的菌落，挑選不同形態(tài)特征的單菌落，進(jìn)行連續(xù)的平板劃線傳代直至在平板上得到形態(tài)單一菌落。拍照記錄菌落形態(tài)，并進(jìn)行簡單染色觀察其顯微形態(tài)。

純化后的菌株接種于改良MRS 液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后以培養(yǎng)液與50%的滅菌甘油以體積比1∶1 混合后，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.2 分離菌株的鑒定 使用菌落及顯微形態(tài)觀察、API50 發(fā)酵試驗(yàn)和16S rDNA 序列分析對(duì)菌株進(jìn)行分類地位鑒定。

1.4.3 抗生素抗性試驗(yàn) 采用K-B 法測定菌株對(duì)30 種抗生素的敏感性。判定結(jié)果依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[14]。

1.4.4 人工消化液耐受試驗(yàn) 將凍存的待測菌株使用改良MRS 液體培養(yǎng)基活化，連續(xù)傳代3 次。取1 mL 培養(yǎng)液加入9 mL 人工胃液中，振蕩均勻，至于37 ℃靜置培養(yǎng)，0 h 和培養(yǎng)2 h 分別取樣測定其活菌數(shù)。取在人工胃液中2 h 的培養(yǎng)液1 mL，加入9 mL 人工腸液中，繼續(xù)置于37 ℃下培養(yǎng)，并分別在0，4 h 取樣，測定其活菌數(shù)。

式中，N1——經(jīng)人工消化液處理6 h 的活菌數(shù)，CFU/mL；N0——經(jīng)人工消化液處理0 h 的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.4.5 免疫調(diào)節(jié)作用 將凍存的待測菌株使用改良MRS 液體培養(yǎng)基活化，連續(xù)傳代3 次，取1 mL培養(yǎng)液4 000 r/min 離心8 min，PBS 洗滌1 次后，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，調(diào)整菌濃度至106CFU/mL 左右，得到重懸液，備用。將THP-1 細(xì)胞濃度調(diào)整為105個(gè)/mL，去除原培養(yǎng)液加入重懸液，孵育3 h 后去除重懸液，PBS 洗滌2 次后使用PBS 重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞。按照RNA 提取試劑盒說明書提取各孔細(xì)胞的總RNA。另設(shè)僅加入培養(yǎng)液的對(duì)照組。

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行各組RNA 的反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。

以cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)引物見表1，反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)程序見表3。結(jié)果根據(jù)相對(duì)定量的計(jì)算公式：2-△△Ct，其中-△△Ct=-[Ct（目的基因，試驗(yàn)組）-Ct（內(nèi)參基因，試驗(yàn)組）]-[Ct（目的基因，對(duì)照組）-Ct（內(nèi)參基因，對(duì)照組）]。

表1 細(xì)胞因子及其引物序列Table 1 Cytokines and primer sequences

表2 熒光定量PCR 反應(yīng)體系Table 2 Quantitative fluorescence PCR reaction system

表3 三步法反應(yīng)程序Table 3 Three-step reaction procedure

1.4.6 發(fā)酵乳制備及評(píng)價(jià) 取傳代活化后的i772菌液10 mL，12 000 r/min 離心10 min 后棄上清，使用生理鹽水重懸后再次離心，重復(fù)3 次得到i772 菌泥備用，另取1 mL 菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。稱取JLB-1510 發(fā)酵劑1～1.2 g，溶解至200 g 生滅菌牛乳中，混勻得種子液。取生牛乳2 kg，按7%比例加入蔗糖，升溫至65 ℃均質(zhì)后，95 ℃沸水浴滅菌10 min，降溫至50 ℃。以10 mL/kg 接種量加入種子液，同時(shí)，將i772 菌泥加入滅菌生牛乳充分混勻，42 ℃靜置發(fā)酵至pH 4.5 左右，破乳后4 ℃靜置過夜。

召集專家級(jí)感官評(píng)價(jià)人員（23 人）對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)方法為整體口感喜好度，用9點(diǎn)強(qiáng)度標(biāo)度法（9→1 表示喜歡→不喜歡，＜5 表示不被喜歡），其它感官特性用10 點(diǎn)強(qiáng)度標(biāo)度法（10→0 表示極強(qiáng)→察覺不到）。采用此方法對(duì)上述發(fā)酵乳樣品進(jìn)行整體喜好度、香氣、甜味、酸味、黏稠度、細(xì)膩度評(píng)價(jià)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并通過Origin 2018 作圖。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定后所得序列，在NCBI 中的BLAST 檢索系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)確定，使用Bioedit 軟件和mega7.0 軟件進(jìn)行鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及鑒定

經(jīng)過分離、純化，得到1 株形態(tài)特征疑似雙歧桿菌的菌株，編號(hào)為i772。其菌落形態(tài)和顯微特征如圖1 所示。菌落圓形凸起，微白不透明，顯微鏡下呈棒狀和分支狀，單生、V 字排列。API50 試驗(yàn)證明其可以利用D-乳糖、L-阿拉伯糖、乳糖、果糖、棉籽糖等（表4）。

圖1 i772 的菌落形態(tài)（a）和顯微形態(tài)（b）Fig.1 Colony morphology（a）and microscopy morphology（b）of i772

表4 i772 的API50 試驗(yàn)結(jié)果Table 4 API50 experimental results for i772

表5 長雙歧桿菌長亞種i772 的抗生素抗性試驗(yàn)Table 5 Antibiotic resistance experiments of i772

進(jìn)一步，將測序得到的DNA 序列利用NCBI中 的 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將其進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)i772 與長雙歧桿菌長亞種同源性最高達(dá)到99%，將待鑒定菌株與部分雙歧桿菌不同種的模式菌株的16S rDNA 序列一起，以植物乳桿菌模式菌株作為外群，采用鄰接法制作系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2 可知，i772 與長雙歧桿菌長亞種ATCC15707 聚為一類。因此，根據(jù)理化結(jié)果和基因分析結(jié)果將i772 鑒定為長雙歧桿菌長亞種i772（Bifidobacterium longum subsp.Longum i772）。

圖2 基于16S rDNA 序列的i772 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The i772 phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences

2.2 i772 的抗生素耐受試驗(yàn)

乳酸菌尤其是雙歧桿菌一般認(rèn)為是安全的，然而隨著基因技術(shù)和轉(zhuǎn)基因乳酸菌的出現(xiàn)，菌株的抗生素耐藥性成為益生菌應(yīng)用前值得關(guān)注的問題。通過K-B 法檢測長雙歧桿菌長亞種i772 對(duì)30 種抗生素的敏感性發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌長亞種i772 對(duì)其中25 種抗生素敏感，安全風(fēng)險(xiǎn)較低。

2.3 i772 的人工消化液耐受試驗(yàn)

益生菌能夠以活菌形式到達(dá)腸道才能更好的定植和發(fā)揮其健康作用。因此能否耐受到達(dá)腸道前的酸堿脅迫是評(píng)價(jià)其能否發(fā)揮健康功能的重要指標(biāo)。表6 可以看出長雙歧桿菌長亞種i772 在初始活菌數(shù)為6.90×108CFU/mL 時(shí)，經(jīng)過2 h 胃液和4 h 腸液處理后存活率達(dá)到3.22%。其中，在胃液中2 h 存活率為3.07%，在腸液中活菌數(shù)不僅沒有下降還略有增長，這一結(jié)果與其它研究報(bào)告結(jié)果相似[22-23]。這可能與人工腸液與長雙歧桿菌長亞種i772 分離自健康嬰兒腸道的原生環(huán)境相似有關(guān)。提示長雙歧桿菌長亞種i772 在腸道環(huán)境中具有生長定植的潛力。

表6 長雙歧桿菌長亞種i772 的消化液耐受試驗(yàn)Table 6 Digestion solution tolerance experiment of i772

2.4 i772 的免疫調(diào)節(jié)作用

IL-8 的主要生物學(xué)活性是吸引和激活中性粒細(xì)胞，這些作用可導(dǎo)致機(jī)體局部的炎癥反應(yīng)，達(dá)到殺菌和細(xì)胞損傷的目的[24]。TLR 基因編碼的蛋白質(zhì)是Toll 樣受體（TLR）家族的成員，該家族在病原體識(shí)別和先天免疫激活中起著基本作用。能夠介導(dǎo)免疫力發(fā)展所必需的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。TNFα 是一種促炎細(xì)胞因子，參與正常炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[25-26]。由圖3 可知，i772 與THP-1 細(xì)胞相互作用3 h 后，細(xì)胞因子IL-8、TLR4、TNF-α mRNA的表達(dá)量為對(duì)照組的12.71，5.71，12.56 倍。因此i772 能夠促進(jìn)THP-1 細(xì)胞中促炎因子表達(dá)，具有一定免疫激活和增強(qiáng)作用。

圖3 長雙歧桿菌長亞種i772 干預(yù)THP-1 細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of genes related to inflammation in the i772 intervention in THP-1 cells

2.5 i772 的發(fā)酵乳制備及風(fēng)味評(píng)價(jià)

將制備好的含有長雙歧桿菌長亞種i772 的發(fā)酵乳與未添加的普通發(fā)酵乳，召集專家級(jí)感官評(píng)價(jià)人員23 人對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果如表7 所示，加入i772 對(duì)于發(fā)酵乳的總體喜好度、總香氣、酸味、甜味和粉感的影響沒有顯著性差異；顯著提高了發(fā)酵乳的口中黏度和黏聚性。李達(dá)等[27]通過研究不同菌株發(fā)現(xiàn)，乳酸菌產(chǎn)生胞外多糖可以改善發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)，發(fā)酵乳更細(xì)膩，同時(shí)提高了黏度和黏附性。李勝杰[28]研究了兩歧雙歧桿菌WBIN03其胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)240 mg/L 左右。推測含i772的發(fā)酵乳口中黏度和黏聚性的提高，可能與其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生胞外多糖，從而改變了發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性有關(guān)。胞外多糖的產(chǎn)生除了能夠提升發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)，也會(huì)賦予益生菌良好的健康作用[29-31]，這還需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

表7 長雙歧桿菌長亞種i772 發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 7 Sensory evaluation results of fermented milk of i772

3 結(jié)論

從健康嬰兒腸道樣品中分離得到1 株疑似雙歧桿菌菌株，經(jīng)過生理生化鑒定為長雙歧桿菌，命名為長雙歧桿菌長亞種i772。進(jìn)一步做抗生素抗性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)25 種抗生素敏感；通過胃腸消化液的存活率為3.22%；能夠提高IL-8、TLR4 和TNF-α 3 種促炎因子的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。通過發(fā)酵和品嘗發(fā)現(xiàn)添加長雙歧桿菌長亞種i772 對(duì)發(fā)酵乳的喜好度、香氣等指標(biāo)無顯著影響，而顯著提高了發(fā)酵乳的口中黏度和黏聚性。未來將進(jìn)一步從HRB 菌株和胞外多糖方向繼續(xù)進(jìn)行研究。