趙秀琳，趙小林，劉秋平，彭珍華，楊韻渲，牛之瑞，馬雪濤，譚建林

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，國(guó)家熱帶農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，昆明 650223）

蘑菇為大型真菌的俗稱，大型真菌通常是指肉眼可見(jiàn)、徒手可摘的真菌[1]。按用途分為食用菌、藥用菌、有毒菌和用途未知菌四大類。蘑菇因其獨(dú)特的鮮味和滋味，受到越來(lái)越多的人青睞。特別是在每年雨季到來(lái)之際，野生食用菌更是食客必選的佳肴。野生菌種類繁多，單靠民間流傳的一些辨別方法，無(wú)法有效分辨其有無(wú)毒性，因此因食用野生蘑菇中毒的事件時(shí)有報(bào)道[2-5]。在毒菇中毒事故中，約90%是由于誤食含鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的野生菌所引起[6]。蘑菇中毒病癥可分為急性肝損傷型、急性腎衰竭型、胃腸炎型、神經(jīng)精神型、溶血型、光過(guò)敏性皮炎型六大類[7]，臨床上常根據(jù)中毒癥狀和檢測(cè)患者尿液或血液中有無(wú)蘑菇毒素來(lái)判斷，從而進(jìn)行相應(yīng)治療。誤食毒菇中毒對(duì)患者身體的損傷是不可估量且難以挽回的，因此準(zhǔn)確檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)蘑菇中的毒素，幫助人們提前認(rèn)識(shí)、區(qū)分毒蘑菇，從而減少誤食的情況，保護(hù)人類身體健康具有重要意義。

目前蘑菇毒素的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法[8]、酶聯(lián)免疫吸附法[9]、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]和液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法[12-13]，而在食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，蘑菇毒素的測(cè)定主要是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法具有高效、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大批量未知蘑菇樣品中蘑菇毒素的含量，因此在食品檢測(cè)中應(yīng)用廣泛[14]。

測(cè)量不確定度表征賦予了被測(cè)量量值的分散性，是測(cè)量結(jié)果的一部分，也是符合性判定規(guī)則考慮的主要內(nèi)容。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分析測(cè)量不確定度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的貢獻(xiàn)，評(píng)定每一項(xiàng)用數(shù)值表示的測(cè)量結(jié)果的測(cè)量不確定度。BJS 202008《蘑菇中α-鵝膏毒肽等6 種蘑菇毒素的測(cè)定》是食品行業(yè)檢測(cè)蘑菇毒素的專用標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法測(cè)量不確定度的評(píng)定未見(jiàn)報(bào)道。筆者根據(jù)JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和CNAS-GL006《化學(xué)分析中的不確定度評(píng)估指南》，參照BJS 202008開(kāi)展高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蘑菇中6種蘑菇毒素方法的不確定度評(píng)定，同時(shí)為測(cè)量其它藥物殘留量的不確定度分析提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：LC-MS 8050型，日本島津儀器有限公司。

電子天平：CPA225D 型，感量為0.1 mg，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)。

移液器：PETTE FIX 型，量程分別為200 μL 和1 000 μL，德國(guó)艾卡集團(tuán)。

HLB 固相萃取小柱：60 mg/3 mL，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

乙腈、甲醇、正己烷、乙酸銨：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥基鬼筆毒肽、羧基二羥基鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：97.3%、90.3%、95.0%、87.4%、98.4%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度均為2%(k=2)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

羧基三羥基鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)溶液：50 μg/mL，溶劑為水，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2%(k=2)，青島普瑞邦生物工程有限公司。

干香菇樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：BEH-C18型色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)沃特世公司)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A 相為5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 相為甲醇；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～2.5 min時(shí)流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)為10%～20%，2.5～3.0 min 時(shí)流動(dòng)相B 的體積分?jǐn)?shù)為20%～45%，3.0～3.1 min 時(shí)流動(dòng)相B 的體積分?jǐn)?shù)為45%～95%，3.1～3.8 min 時(shí)流動(dòng)相B 的體積分?jǐn)?shù)為95%，3.8～3.85 min 時(shí)流動(dòng)相B 的體積分?jǐn)?shù)為95%～10%，3.85～6 min 時(shí)流動(dòng)相B 的體積分?jǐn)?shù)為10%；流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧正離子模式(ESI+)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；接口電壓：4 000 V；霧化氣流量：2.9 L/min；加熱氣和干燥氣流量：10.0 L/min；接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；碰撞氣：氬氣。6種蘑菇毒素的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 6種蘑菇毒素的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters of six mushroom toxins

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥基鬼筆毒肽、羧基二羥基鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)品0.1 mg 于5 只10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，配制成質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取羧基三羥基鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，配制成2.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，各儲(chǔ)備液于-18 ℃冰箱保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取羧基三羥基鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液4 mL和其它5種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL 于同一只10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，配制成各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液50、100、200 μL，分別加入950、900、800 μL 體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇水溶液，配制成各化合物質(zhì)量濃度均分別為50、100、200 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50、100 μL，分別加入950、900 μL 50%甲醇水溶液，配制成各化合物質(zhì)量濃度均分別為5、10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品制備

選取適量的干香菇樣品，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，充分混勻后置于潔凈容器中密封并標(biāo)記，于室溫下避光保存。

1.4.2 樣品提取

準(zhǔn)確稱取0.4 g (精確至0.001 g)粉碎后的干香菇樣品，置于15 mL具塞塑料離心管中，加入6.0 mL甲醇，混勻，于渦旋振蕩器上渦旋1 min，超聲提取20 min，冷卻至室溫，以7 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，準(zhǔn)確吸取上清液4.0 mL，置于另一離心管中，于45 ℃下氮吹至近干，用4.0 mL水溶解殘?jiān)尤?.0 mL 正己烷，渦旋1 min，以7 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心6 min，棄去上層正己烷，準(zhǔn)確移取水相待凈化液3.0 mL (相當(dāng)于0.2 g 干香菇樣品)至HLB 固相萃取柱中，以約1 mL/min 的流量全部通過(guò)小柱后，用3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%甲醇水溶液淋洗、抽干，加入2 mL乙腈-甲醇混合液(體積比為3∶7)洗脫，洗脫液于45 ℃下氮吹至干，準(zhǔn)確加入1.00 mL 初始比例流動(dòng)相，渦旋1 min 溶解殘?jiān)?，以濾膜過(guò)濾，作為樣品溶液。

2 測(cè)量模型

樣品溶液中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式(1)計(jì)算：

式中：w——蘑菇樣品中目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg；

ρ——利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的目標(biāo)物質(zhì)量濃度，ng/mL；

V1——提取液體積，mL (V1=6.0 mL)；

V2——樣品提取液過(guò)凈化柱的體積，mL (V2=3.0 mL)；

V3——樣品溶液上機(jī)前的定容體積，mL (V3=1.0 mL)；

m——蘑菇樣品質(zhì)量，g。

3 不確定度來(lái)源

根據(jù)分析方法和實(shí)驗(yàn)步驟，6 個(gè)目標(biāo)物測(cè)量結(jié)果的不確定度主要來(lái)源包括： (1) 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度； (2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度； (3) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的測(cè)量不確定度； (4)樣品處理引入的不確定度； (5) 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度。對(duì)于一些通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明比較穩(wěn)定的因素，如樣品的均勻性、實(shí)驗(yàn)室溫度(與校準(zhǔn)溫度相差低于2 ℃)等，評(píng)定測(cè)量不確定度時(shí)不予考慮。

4 不確定度評(píng)定

因?yàn)? 個(gè)目標(biāo)物分析方法相同，測(cè)量不確定度評(píng)定方法也相同，故以α-鵝膏毒肽為例介紹評(píng)定過(guò)程。

4.1 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度

對(duì)同一樣品進(jìn)行6 次獨(dú)立重復(fù)測(cè)量，α-鵝膏毒肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定值分別為135.7、134.9、141.2、133.2、139.8、133.3 μg/kg，平均值為136.4 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=3.38，重復(fù)性測(cè)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書查閱到α-鵝膏毒肽純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為97.3%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2% (k=2)，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.2.4 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中引入的不確定度

以200 μL移液器為例，根據(jù)JJG 646—2006 《移液器檢定規(guī)程》和移液器檢定證書，200 μL 移液器在移取50、100 μL 時(shí)，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.7%，k=2，移取200 μL 時(shí)，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.4%，k=2，移液器移取不同體積溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表2。

表2 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量Tab.2 Relative standard uncertainty component introduced in the preparation of a series of mixed standard working solutions

以1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用200 μL和1 000 μL移液器完成稀釋，50、100、200 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋了1 次，5、10 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋了2 次，計(jì)算時(shí)應(yīng)重復(fù)計(jì)算不確定度。根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》和移液器檢定證書，200 μL 移液器和1 000 μL 移液器在移取50、100、200 μL時(shí)，允許誤差見(jiàn)表2，系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見(jiàn)表2。利用表2數(shù)據(jù)合成得系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量以及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容體積引入的不確定度

當(dāng)稱樣量小于5 g 時(shí)，天平允許的最大誤差為±0.05 mg，稱取α-鵝膏毒肽標(biāo)準(zhǔn)品1 mg；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容用10 mL容量瓶(A級(jí))，參閱文獻(xiàn)[15]可知，A級(jí)10 mL 容量瓶的允許誤差為±0.02 mL，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.2.3 配制混合標(biāo)準(zhǔn)中間液引入的不確定度

配制混合標(biāo)準(zhǔn)中間液時(shí)，使用1 mL A級(jí)單標(biāo)吸量管準(zhǔn)確移取1 mLα-鵝膏毒肽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。參照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃量器》，1 mL A級(jí)單標(biāo)吸量管、10 mL A級(jí)容量瓶的最大允許誤差分別為0.007、0.020 mL，按矩形分布，k= 3，配制混合標(biāo)準(zhǔn)中間液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、混合標(biāo)準(zhǔn)中間液、系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，得標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的測(cè)量不確定度

考慮到儀器檢測(cè)過(guò)程中引入的不確定度，直接引用儀器的檢定證書作為評(píng)價(jià)依據(jù)。儀器的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為3.3%，k=2。則儀器檢測(cè)過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.4 樣品處理引入的不確定度

4.4.1 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

天平校準(zhǔn)允許的最大誤差為±0.000 05 g，樣品稱取質(zhì)量(m)為0.4 g，按矩形分布，k= 3，樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.4.2 樣品提取引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

分析樣品處理步驟，用10 mL B 級(jí)流出式分度吸量管吸取6.0 mL甲醇，5 mL B級(jí)流出式分度吸量管吸取4.0 mL上清液，5 mL B級(jí)流出式分度吸量管吸取4.0 mL 水，5 mL B 級(jí)流出式分度吸量管吸取3.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%甲醇水溶液，1 000 μL移液器吸取1.00 mL 初始比例流動(dòng)相，根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》可以計(jì)算由樣品提取引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

由于上述各因素互不相關(guān)，樣品處理過(guò)程引入的不確定度：

4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，按照最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性方程為y=82.156 5x-322.693。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(L)按式(2)、式(3)計(jì)算[15-16]：

式中：sR——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

b——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率；

p——樣品平行測(cè)定的次數(shù)，p=6；

n——標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)，n=5；

x0——樣品溶液質(zhì)量濃度，ng/mL；

xˉ——系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度，73 ng/mL；

yi——第i標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的色譜峰面積；

xi——第i標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的質(zhì)量濃度ng/mL；

a——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的截距。

樣品平行測(cè)定6 次，樣品溶液中α-鵝膏毒肽質(zhì)量濃度分別為27.14、26.97、28.23、26.65、27.96、26.65 ng/mL，x0=27.27 ng/mL。將相關(guān)數(shù)據(jù)代入式(2)、式(3)，得sR為0.329 5，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(L)=0.292 9 ng/mL，則標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定及擴(kuò)展不確定度

以上各不確定度分量互不相關(guān)，因此蘑菇中α-鵝膏毒肽測(cè)定結(jié)果的合成相對(duì)不確定度：

取置信水平P=95%，包含因子k=2，α-鵝膏毒肽含量測(cè)定結(jié)果的相對(duì)擴(kuò)展不確定度按照Urel=k×urel計(jì)算。β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥基鬼筆毒肽、羧基二羥基鬼筆毒肽和羧基三羥基鬼筆毒肽依據(jù)同樣的不確定度評(píng)定過(guò)程，評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 6種蘑菇毒素合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和檢測(cè)結(jié)果報(bào)告Tab.3 Combined standard uncertainty and test result report of six mushroom toxin

5 結(jié)語(yǔ)

根據(jù)BJS 202008《蘑菇中α-鵝膏毒肽等6 種蘑菇毒素的測(cè)定》，對(duì)蘑菇中6 種蘑菇毒素進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)測(cè)定結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定。樣品重復(fù)測(cè)量和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度最大，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，其它影響因素較小。在實(shí)際工作中，需要定期對(duì)移液器和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)保養(yǎng)；購(gòu)買具有合格檢驗(yàn)證書的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品移取用具；同時(shí)提升檢測(cè)人員的操作規(guī)范和穩(wěn)定性，熟悉檢測(cè)方法，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。