劉康連，梁曉玲，黎強(qiáng)，樊文研，龐云娟，陳宇

［玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，玉林中藥材（含香辛料）質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)價(jià)工程技術(shù)中心，廣西玉林 537000］

明膠空心膠囊是用明膠加輔料制成的空心硬膠囊，作為膠囊劑中的一種特殊輔料，廣泛應(yīng)用于中藥制劑、保健食品等膠囊劑[1-2]。膠囊劑為除了片劑以外的口服固體制劑的主要?jiǎng)┬椭?，明膠空心膠囊作為膠囊劑型藥物的載體，隨藥物進(jìn)入人體消化系統(tǒng)，最終被人體所吸收[2]，因此明膠空心膠囊的質(zhì)量安全直接影響藥品和保健食品的質(zhì)量安全[2-4]。《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020 年版四部對(duì)明膠空心膠囊有明確的微生物限度要求，而明膠空心膠囊的主要原料明膠是細(xì)菌繁殖的優(yōu)良培養(yǎng)基，要使其達(dá)到藥典規(guī)定的微生物限度要求，除了嚴(yán)格控制明膠的衛(wèi)生指標(biāo)與明膠空心膠囊的生產(chǎn)過程外，生產(chǎn)企業(yè)通常會(huì)加入一定量的防腐劑?！吨袊?guó)藥典》對(duì)明膠空心膠囊中防腐劑的檢查主要是針對(duì)其滅菌工藝涉及到的防腐劑殘留，檢查項(xiàng)目只有對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯乙醇、環(huán)氧乙烷3 種，目前還沒有明膠空心膠囊中苯甲酸、山梨酸等防腐劑的檢查方法。苯甲酸鈉和山梨酸鉀因價(jià)格低廉且具有廣譜的抑菌效果，在食品、藥品、化妝品中應(yīng)用廣泛[5]。如果明膠空心膠囊生產(chǎn)者在生產(chǎn)過程中過多添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀等防腐劑，達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)有過強(qiáng)的抑菌作用，不僅影響到明膠空心膠囊微生物限度檢查方法的建立[6]，也會(huì)影響到其藥品制劑微生物限度檢查方法的建立[7-9]。此外苯甲酸鈉、山梨酸鉀的使用安全性也不可忽略，苯甲酸鈉ADI (每日人體每千克體重允許攝入的質(zhì)量，單位為mg)為0～5 mg/kg，LD50 (半數(shù)致死量)為4 070 mg/kg[10]，其安全性也會(huì)影響到患者用藥的安全。

目前測(cè)定食品藥品中苯甲酸、山梨酸的方法有高效液相色譜法[11-13]、氣相色譜法[14-16]等。明膠空心膠囊中水溶性蛋白質(zhì)含量較高，難以通過單一加入蛋白沉淀劑來去除樣品溶液中蛋白質(zhì)的影響。黃銀波等[17-19]對(duì)食品中苯甲酸、山梨酸的測(cè)定分析結(jié)果表明，C18固相萃取小柱對(duì)苯甲酸、山梨酸有很好的吸附作用，且提取率高。筆者參考食品中苯甲酸、山梨酸的提取方法對(duì)明膠空心膠囊樣品處理方法進(jìn)行優(yōu)化，樣品經(jīng)水浴溶解，加入蛋白質(zhì)沉淀劑，用C18固相萃取小柱去除蛋白質(zhì)，在此基礎(chǔ)上建立了明膠空心膠囊中苯甲酸鹽(以苯甲酸計(jì))、山梨酸鹽(以山梨酸計(jì))的高效液相色譜檢查方法。該方法能夠有效地去除蛋白質(zhì)、部分色素及其它雜質(zhì)的干擾，提取方法操作簡(jiǎn)便，提取回收率高，滿足明膠空心膠囊中苯甲酸和山梨酸的測(cè)定要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，配二極管陣列(DAD)檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子分析天平：XS-205Du 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

高速冷凍離心機(jī)：ROTANTA 460R 型，德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司。

水浴恒溫振蕩器：SHZ-88 型，江蘇金怡儀器科技有限公司。

pH計(jì)：FE20型，瑞士梅特勒-托利多公司。

苯甲酸對(duì)照品：批號(hào)為G139784，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，德國(guó)Dr·Ehrenstorfer GmbH公司。

山梨酸對(duì)照品：批號(hào)為C0005882，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%，北京曼哈格生物科技有限公司。

甲醇：色譜純，美國(guó)Fisher chemical公司。

甲酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

乙酸銨：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

亞鐵氰化鉀[K4[Fe (CN)6]·3H2O]、乙酸鋅[Zn(CH3COO)2·2H2O]：均為分析純，廣東光華科技股份有限公司。

冰乙酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

明膠空心膠囊樣品：由藥品生產(chǎn)企業(yè)單位提供。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：2 mmol/L甲酸與20 mmol/L乙酸銨混合溶液-甲醇(體積比為90∶10)，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：等度洗脫。

1.3 溶液配制

苯甲酸、山梨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液：質(zhì)量濃度均為5 g/L，分別精密稱取苯甲酸、山梨酸對(duì)照品各0.1 g(精確至0.000 1 g)于兩只20 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解并分別定容至標(biāo)線，搖勻。

苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：兩組分質(zhì)量濃度均為200 mg/L，分別精密移取苯甲酸、山梨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL于同一只50 mL容量瓶中，用水定容至標(biāo)線，搖勻。

苯甲酸、山梨酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0、0.05、0.25、0.50、1.00、2.50 mL，用水定容至10 mL，配制成苯甲酸、山梨酸質(zhì)量濃度均分別為0、1、5、10、20、50 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 mmol/L甲酸-20 mmol/L乙酸銨混合溶液：稱取1.54 g 乙酸銨，加入適量水溶解，再加入75.2 μL甲酸，用水定容至1 000 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm 尼龍濾膜過濾。

1.4 樣品處理

稱取明膠空心膠囊樣品約0.5 g 于50 mL 聚四氟乙烯具塞離心管中，精密稱定，加入10 mL 水，于60 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩溶解提取30 min，冷卻至室溫后分別加入0.25 mol/L 亞鐵氰化鉀溶液和1.0 mol/L 乙酸鋅溶液各2 mL，用水稀釋定容至20 mL，渦旋混勻，以4 600 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取5.0 mL上清液，加入冰乙酸約0.3 mL調(diào)pH至3～4。取一支C18固相萃取小柱，分別用5 mL甲醇和5 mL水活化后上樣，用5 mL 水清洗一次，再用3 mL 60%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液于15 mL離心管中，用60%甲醇水溶液稀釋至5.0 mL，混勻，經(jīng)0.45 μm尼龍濾膜過濾，作為樣品溶液。

同法制備空白對(duì)照溶液(除不用明膠空心膠囊樣品外，其余操作同樣品溶液制備方法)。

1.5 測(cè)定方法

取苯甲酸、山梨酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，按照1.3色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算明膠空心膠囊中苯甲酸和山梨酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法及浸提溶劑選擇

明膠空心膠囊主要原料明膠屬于蛋白類物質(zhì)(骨膠或皮膚)，為水溶性蛋白。樣品預(yù)處理方法中苯甲酸、山梨酸的提取大多數(shù)為水提取。參考文獻(xiàn)[20-21]，采用水浸提，選用亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液為蛋白沉淀劑。

通過樣品加標(biāo)的方法分別考察加入等量甲醇、等量乙醚的提取效果。結(jié)果表明，加入等量甲醇提取率雖然高，但是雜質(zhì)多，對(duì)檢測(cè)目標(biāo)物干擾大，不利于準(zhǔn)確定量，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)且容易對(duì)色譜柱造成污染，降低色譜柱柱效；加入等量乙醚提取，雖然雜質(zhì)少，但是乙醚不僅揮發(fā)性大，對(duì)環(huán)境不友好，而且在提取過程中容易出現(xiàn)乳化，目標(biāo)物損失較多。故樣品第一步提取選擇直接用水浸提，不需要進(jìn)行反向提取。

樣品經(jīng)水浸提后，對(duì)蛋白沉淀劑的加入體積進(jìn)行考察。結(jié)果表明，沉淀劑的加入體積分別為1、2、3、4、5 mL 時(shí)，沉淀物的濕重呈增加趨勢(shì)，增重差約為1 g，表明當(dāng)沉淀劑加入體積為5 mL時(shí)，樣品溶液中蛋白質(zhì)并未充分沉淀。當(dāng)沉淀劑的加入體積為1 mL時(shí)，離心后上清液難以通過C18固相萃取小柱；而當(dāng)沉淀劑的加入體積不小于2 mL時(shí)，離心后的上清液可以順利通過C18固相萃取小柱。出于節(jié)約試劑考慮，選擇蛋白沉淀劑加入體積為2 mL。

分別考察離心后的上清液不調(diào)節(jié)pH和調(diào)節(jié)pH至3～4 后過C18固相萃取小柱苯甲酸、山梨酸的回收率。結(jié)果表明，苯甲酸的回收率分別為79.4%和98.2%，山梨酸的回收率分別為83.7%和86.0%，上清液調(diào)節(jié)pH 至3～4 后再過C18固相萃取小柱的回收率明顯更高，所以離心后的上清液調(diào)節(jié)pH至3～4后再過C18固相萃取小柱。

考察不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液洗脫時(shí)苯甲酸和山梨酸的回收率，結(jié)果見表1。由表1 可知，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%～80%時(shí)，苯甲酸和山梨酸的回收率為90%～110%，綜合考慮苯甲酸、山梨酸高濃度時(shí)的洗脫效果，最終選擇體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇水溶液作為洗脫液。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液洗脫時(shí)苯甲酸、山梨酸的回收率Tab.1 Recovery rates of benzoic acid and sorbic acid during washing with methanol aqueous solutions of different volume fractions %

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器對(duì)苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，光譜圖如圖1和圖2所示。由圖1 和圖2 可以看出，苯甲酸的最大吸收波長(zhǎng)為228 nm，山梨酸的最大吸收波長(zhǎng)為254 nm，為了同時(shí)檢測(cè)苯甲酸和山梨酸，參考GB 5009.28—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。在此波長(zhǎng)處苯甲酸、山梨酸均有較高吸收值，靈敏度較高。

圖1 苯甲酸光譜圖Fig.1 Spectrogram of benzoic acid

圖2 山梨酸光譜圖Fig.2 Spectrogram of sorbic acid

2.2.2 色譜柱選擇

分別選擇Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-Aq 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Waters Atlanntis? T3 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，3 種色譜柱對(duì)苯甲酸、山梨酸均有良好的分離效果，且峰形尖銳對(duì)稱，其中Agilent Zorbax SB-Aq 色譜柱保留時(shí)間最短，分析時(shí)間最短。此外Agilent Zorbax SB-Aq 色譜柱屬于水相柱，具有親水性的表面，即使使用水為流動(dòng)相，也可以有效地防止固定相的塌陷，適用于難分離的酸性、堿性和極性化合物，其保留作用比C18色譜柱強(qiáng)，故選擇Agilent Zorbax SB-Aq 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作為分析柱。

2.2.3 流動(dòng)相選擇

以苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品溶液為待測(cè)溶液，考察2 mmol/L甲酸-20 mmol/L乙酸銨混合溶液與甲醇的體積比分別為95∶5、90∶10、85∶15 共3 種不同流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明，在3種不同流動(dòng)相下，苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰分離度均大于1.5；當(dāng)2 mmol/L甲酸-20 mmol/L乙酸銨混合溶液與甲醇的體積比為90∶10 時(shí)，加標(biāo)樣品溶液中苯甲酸、山梨酸與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度均不小于1.5，且該流動(dòng)相系統(tǒng)分析時(shí)間相對(duì)較短，所以最終選擇以2 mmol/L甲酸-20 mmol/L乙酸銨混合溶液與甲醇的體積比為90∶10作為流動(dòng)相。

2.2.4 其它色譜條件

柱溫、流量、進(jìn)樣體積參考GB 5009.28—2016選擇，苯甲酸、山梨酸均能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離，且峰形良好。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別吸取空白對(duì)照溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及陽(yáng)性樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖分別如圖3～圖5 所示。圖3～圖5 結(jié)果表明，空白對(duì)照溶液無干擾，樣品溶液中苯甲酸、山梨酸的保留時(shí)間分別約為6.0 min 和9.8 min，與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯甲酸、山梨酸的保留時(shí)間一致，兩組分峰形良好，分離效果良好，表明該方法專屬性良好。

圖3 空白對(duì)照溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank control solution

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of mixed standard solution

圖5 陽(yáng)性樣品溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of positive sample solution

2.4 線性方程與檢出限、定量限

按照1.2色譜條件分別測(cè)定苯甲酸、山梨酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

稱取陰性樣品2 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液10、20 μL，按1.4 方法制備樣品溶液，在1.2 色譜條件下測(cè)定，按取樣質(zhì)量為0.5 g，稀釋體積為20 mL，以3 倍信噪比計(jì)算各組分的方法檢出限，以10倍信噪比計(jì)算各組分的定量限。

苯甲酸、山梨酸質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表2。由表2 可知，苯甲酸、山梨酸的質(zhì)量濃度在0～50 mg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表2 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Tab.2 Linear range of mass concentration, linear equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit

2.5 精密度試驗(yàn)

取陽(yáng)性樣品6份，各0.5 g，精密稱定，按照1.4方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下分別測(cè)定，結(jié)果見表3。由表3 可知，苯甲酸、山梨酸測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.9%、2.2%，表明該方法精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Precision test results

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取苯甲酸、山梨酸的質(zhì)量濃度均為10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于配制完成后第0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。由表4 可知，兩組分色譜峰峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.10%、0.22%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Stability test results

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取明膠空心膠囊9 份，每份0.5 g，置于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，分別加入苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.5、1、4 mL，然后加入水至10 mL，按1.4方法制備加標(biāo)樣品溶液，在1.2色譜條件下測(cè)定，每種質(zhì)量濃度的溶液平行測(cè)定3份，結(jié)果見表5。由表5 可知，苯甲酸加標(biāo)平均回收率為101.3%～106.1%，山梨酸加標(biāo)平均回收率為92.4%～96.0%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，滿足實(shí)際樣品測(cè)定要求。加標(biāo)樣品溶液色譜圖如圖6所示。

圖6 加標(biāo)樣品溶液色譜圖Fig.6 Chromatogram of spiked sample solution

表5 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Sample addition recovery test results

3 結(jié)語(yǔ)

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定明膠空心膠囊中苯甲酸鹽(以苯甲酸計(jì))、山梨酸鹽(以山梨酸計(jì))含量的檢測(cè)方法。該方法專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，靈敏度和準(zhǔn)確度高，精密度良好，可用于明膠空心膠囊中除藥典工藝防腐劑環(huán)氧乙烷、氯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸酯類以外的防腐劑苯甲酸和山梨酸的測(cè)定。該方法補(bǔ)充了明膠空心膠囊在防腐劑質(zhì)量控制方面的不足，可為藥用輔料明膠空心膠囊的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考，也可為市場(chǎng)監(jiān)管監(jiān)測(cè)苯甲酸鹽和山梨酸鹽在明膠空心膠囊中的使用提供檢測(cè)技術(shù)支持。