籍瑞芳，劉會(huì)，史敏，林超

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濟(jì)南 250102）

桑寄生配方顆粒是以中藥飲片桑寄生為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等現(xiàn)代生產(chǎn)工藝制成的新型中藥顆粒劑，經(jīng)中醫(yī)臨床配方后，與其它配方顆粒一起沖服使用[1]。由于配方顆粒具有方便沖服、易于攜帶、安全衛(wèi)生等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為中藥飲片的重要替代品。特別是在2021年11月1日《關(guān)于結(jié)束中藥配方顆粒試點(diǎn)工作的公告》正式實(shí)施之后，中藥配方顆粒迎來(lái)了更加廣闊的發(fā)展空間[2]。目前臨床常用的飲片品種約為400 個(gè)，已頒布國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的配方顆粒品種有248 個(gè)，已頒布山東省藥品標(biāo)準(zhǔn)的配方顆粒品種有366 個(gè)，可見(jiàn)60%以上的臨床常用飲片可以用配方顆粒代替。常規(guī)檢驗(yàn)方法對(duì)配方顆粒市場(chǎng)可以起到監(jiān)督和評(píng)價(jià)作用，但面對(duì)日益擴(kuò)大的市場(chǎng)，這些方法往往耗時(shí)較長(zhǎng)、操作復(fù)雜、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較嚴(yán)格，難以應(yīng)對(duì)快速增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，因此需要建立一種能夠滿(mǎn)足大批量快速檢驗(yàn)要求的方法。

近紅外光譜(NIRS)法是通過(guò)測(cè)定物質(zhì)在近紅外光譜區(qū)的特征光譜，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取相關(guān)信息，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的光譜分析技術(shù)[3]。由于該方法具有對(duì)樣品無(wú)破壞、操作簡(jiǎn)單、不產(chǎn)生毒害物質(zhì)、高效便捷等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品、中藥材、生物制品、化工產(chǎn)品等領(lǐng)域，而用于配方顆粒質(zhì)量研究文獻(xiàn)報(bào)道較少。孫夏榮等[4]利用近紅外光譜對(duì)當(dāng)歸配方顆粒進(jìn)行了一致性檢驗(yàn)；李軍山等[5]通過(guò)近紅外光譜建立了赤芍配方顆粒中芍藥苷和浸出物的含量測(cè)定模型，為配方顆粒的定性、定量分析開(kāi)辟了新方法。由于近紅外光譜基頻振動(dòng)弱，吸收峰重疊，需要利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取相關(guān)信息，目前研究的重點(diǎn)集中在探索更加準(zhǔn)確的分析方法，建立穩(wěn)定的分析模型。

桑寄生中的主要藥物活性成分為黃酮類(lèi)化合物[6]，桑寄生配方顆粒的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定項(xiàng)下是以槲皮苷為指標(biāo)物質(zhì)。筆者將桑寄生配方顆粒通過(guò)高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定的槲皮苷含量值與其近紅外光譜相關(guān)聯(lián)，利用偏最小二乘(PLS)法，建立桑寄生配方顆粒中槲皮苷的定量分析模型，并對(duì)模型進(jìn)行了驗(yàn)證，為快速測(cè)定桑寄生配方顆粒中槲皮苷的含量提供了參考方法，為實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥配方顆粒的現(xiàn)場(chǎng)鑒定及提高藥品質(zhì)量監(jiān)管水平提供有力的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200 型，附有ChemStation工作站，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子天平：(1) MS205DU 型，感量為0.01 mg；(2) MS204TS/02 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

傅里葉變換近紅外光譜儀：MATRIX-F 型，配漫反射光纖探頭和OPUS 5.0分析軟件，德國(guó)布魯克光譜儀器公司。

槲皮苷對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為93.5%，批號(hào)為111538-202007，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

桑寄生配方顆粒樣品：共90批，市售。

乙腈：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×4.6 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液，體積比為20∶80，流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

1.2.2 槲皮苷對(duì)照品溶液制備

取槲皮苷對(duì)照品9.51 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入稀乙醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成槲皮苷質(zhì)量濃度為88.92 μg/mL的槲皮苷對(duì)照品溶液。

1.2.3 桑寄生配方顆粒樣品溶液制備

取桑寄生配方顆粒，研細(xì)，精密稱(chēng)取約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為桑寄生配方顆粒樣品溶液。

1.2.4 槲皮苷含量測(cè)定

分別精密吸取槲皮苷對(duì)照品溶液和桑寄生配方顆粒樣品溶液，按1.2.1 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用色譜峰面積外標(biāo)法計(jì)算90 批桑寄生配方顆粒樣品中槲皮苷的含量。

1.2.5 近紅外光譜的采集

取桑寄生配方顆粒樣品，研細(xì)，裝入塑料袋中，將光纖探頭在塑料袋外，對(duì)準(zhǔn)顆粒直接進(jìn)行光譜測(cè)定，采集近紅外光譜。采集光譜范圍為4 000～12 000 cm-1，分辨率為8 cm-1，掃描次數(shù)為32次。每份樣品測(cè)定3 次，取其平均光譜數(shù)據(jù)用于建立定量分析模型。

1.2.6 定量分析模型建立

通過(guò)主成分分析(PCA)法結(jié)合HotellingT2方法[7]剔除異常紅外光譜樣本，優(yōu)選出最佳的樣本劃分方法，將HPLC 法測(cè)得的桑寄生配方顆粒樣品中的槲皮苷含量與其近紅外光譜相結(jié)合，采用PLS法，用校正集樣本建立桑寄生配方顆粒中槲皮苷的定量分析模型，并用驗(yàn)證集樣本對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證。在近紅外定量分析模型中，交叉檢驗(yàn)均方根誤差(RMSECV)、預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)和決定系數(shù)(R2)是衡量模型的重要依據(jù)。其中RMSECV 和RMSEP 值越小，表明模型結(jié)構(gòu)越合理，預(yù)測(cè)值與參考值的差異越小；R2越接近100%，證明模型的預(yù)測(cè)值與樣品參考值的相關(guān)性越好，模型的準(zhǔn)確性越高[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品中槲皮苷含量HPLC法測(cè)定值

槲皮苷的含量測(cè)定方法采用國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ-PFKL-2021107 中桑寄生配方顆粒含量測(cè)定方法。槲皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.768 2～7.199 7 mg/g。槲皮苷對(duì)照品溶液和樣品溶液的色譜圖如圖1 所示。HPLC法測(cè)定的含量值是建立定量分析模型的一級(jí)數(shù)據(jù)，也是判斷預(yù)測(cè)值是否準(zhǔn)確的重要參考。

圖1 槲皮苷對(duì)照品溶液和桑寄生配方顆粒樣品溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of quercitrin reference solution（a） and Taxilli herba formula granule sample solution（b）

2.2 近紅外光譜圖

桑寄生配方顆粒樣品的近紅外光譜圖如圖2所示。90 批桑寄生配方顆粒樣品的近紅外光譜除吸收強(qiáng)度不同之外，峰形基本一致。

圖2 桑寄生配方顆粒的近紅外光譜圖Fig.2 Near-infrared spectrum of Taxilli herba formula granule

2.3 異常光譜剔除

在近紅外光譜采集過(guò)程中，由于環(huán)境溫度和濕度的變化、檢驗(yàn)人員的操作失誤，以及樣品的厚度不均勻等因素，會(huì)導(dǎo)致異常光譜的出現(xiàn)，對(duì)模型精確度產(chǎn)生影響[9]，因此在建立模型之前，應(yīng)當(dāng)對(duì)異常光譜進(jìn)行識(shí)別和剔除。

利用PCA法結(jié)合HotellingT2方法對(duì)90批桑寄生配方顆粒樣品的近紅外光譜進(jìn)行異常樣本檢測(cè)，結(jié)果如圖3 所示。圖中18#樣本位于99%置信期間之外，為異常樣本，剔除18#樣本后得到89 份樣本，將其數(shù)據(jù)用于定量分析模型的建立。

圖3 桑寄生配方顆粒樣品近紅外光譜Hotelling T 2檢驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Hotelling T 2 test result of near-infrared spectrum of Taxilli herba formula granule

2.4 校正集與驗(yàn)證集劃分

劃分校正集和驗(yàn)證集的常用方法有隨機(jī)(RS)法、Kennard-Stone (KS)法和X-Y 聯(lián)合距離的樣本集劃分(SPXY)法。RS法即隨機(jī)選取一定量的樣本組成校正集和驗(yàn)證集；KS法是通過(guò)計(jì)算光譜樣本間的歐氏距離，使在規(guī)定的樣本集內(nèi)，樣本按照空間距離分布均勻，盡可能包含多樣的樣本信息；SPXY法以KS法為基礎(chǔ)，綜合考慮參考值變量，使樣本在光譜空間和參考值空間權(quán)重相同，從而使樣本集的分布更加均勻，改善模型的預(yù)測(cè)能力[10]。

將89 個(gè)樣本中的3/4 (67 個(gè))作為校正集，1/4(22 個(gè))作為驗(yàn)證集，分別采用RS 法、KS 法和SPXY法進(jìn)行劃分，在對(duì)光譜無(wú)預(yù)處理和全光譜條件下，對(duì)三種劃分方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1數(shù)據(jù)可知，三種方法中，SPXY 法的RMSECV 值最小，R2值更接近100%，說(shuō)明該方法劃分出的校正集和驗(yàn)證集更加合理。67 個(gè)校正集樣本中槲皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為3.768 2～7.199 7 mg/g，包含了槲皮苷的最大值、最小值，其余22個(gè)樣本為驗(yàn)證集，其槲皮苷的含量范圍均被校正集范圍包含，可用于判斷模型的預(yù)測(cè)能力。

表1 三種樣本劃分方法的結(jié)果Tab.1 Three sample partitioning methods results

2.5 光譜預(yù)處理方法選擇

光譜預(yù)處理能有效提取光譜中的有效信息，消除在采集過(guò)程中由于噪聲、背景、雜散光等因素產(chǎn)生的干擾信息，提高光譜模型的預(yù)測(cè)效果[11]。常用的光譜處理方法有原始光譜(NONE)法、線性補(bǔ)償差減(COE)法、直線差減(SLS)法、矢量歸一化(VN)法、最小-最大歸一(M-MN)法、多元散射校正(MSC)法、一階導(dǎo)數(shù)(FD)法、二階導(dǎo)數(shù)(SD)法等。在全光譜條件下，對(duì)上述幾種方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果列于表2。由表2可知，VN法的RMSECV值最小，R2值最大，VN法可以消除光程變化導(dǎo)致的基線平移[12]。

表2 十二種光譜預(yù)處理方法的結(jié)果Tab.2 Results of twelve spectral pretreatment methods

2.6 光譜區(qū)間選擇

采用VN 法預(yù)處理光譜，選擇12 000～4 000 cm-1(全光譜)，7 502～4 597.6 cm-1(軟件自動(dòng)優(yōu)化功能選出的光譜區(qū))以及7 256～6 817 cm-1、5 736～5 052 cm-1(槲皮苷的光譜疊加敏感區(qū)[13])分別進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果列于表3。由表3 數(shù)據(jù)可知，最佳光譜區(qū)為7 502～4 597.6 cm-1。

表3 三種光譜區(qū)間的結(jié)果Tab.3 Results of three spectral intervals

2.7 主因子數(shù)選擇

定量分析模型的質(zhì)量取決于所需因子的數(shù)量，主因子數(shù)太少會(huì)因擬合不足導(dǎo)致模型不能解釋全部特性，但主因子數(shù)太多會(huì)導(dǎo)致過(guò)度擬合而增加噪聲，降低模型的質(zhì)量即預(yù)測(cè)能力[14]。

圖4 是在經(jīng)VN 法預(yù)處理光譜，選用7 502～4 597.6 cm-1光譜區(qū)間條件下RMSECV 與主因子數(shù)的關(guān)系圖，當(dāng)主因子數(shù)大于11 之后，RMSECV 值變化幅度變緩，所以最佳主因子數(shù)為11。

圖4 交叉檢驗(yàn)均方根誤差與主因子數(shù)的相關(guān)圖Fig.4 Correlation graph of the root mean square error of cross validation with the number of principal components

2.8 定量分析模型建立

測(cè)定桑寄生配方顆粒樣品中槲皮苷含量的定量分析模型參數(shù)總結(jié)于表4。

表4 定量分析模型的參數(shù)Tab.4 Parameters of the quantitative analysis model

2.9 定量分析模型驗(yàn)證

按照上述定量分析模型，對(duì)驗(yàn)證集樣本中的槲皮苷含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，圖5 為HPLC 法測(cè)得桑寄生配方顆粒樣品中槲皮苷含量值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖，模型的RMSEP 為0.132，R2為98.68%，剩余預(yù)測(cè)偏差(RPD)為8.98。如果RPD 大于10，說(shuō)明所建模型可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)所測(cè)成分的含量值；RPD在5～10之間，說(shuō)明模型可以用于質(zhì)量控制；RPD 在2.5～5 之間，說(shuō)明模型只能對(duì)所測(cè)成分的含量值進(jìn)行高低判斷[15]。

圖5 驗(yàn)證集樣品預(yù)測(cè)值與高效液相色譜法測(cè)定值相關(guān)圖Fig.5 Correlation graph of the predicted value of the validation set sample and the determined value by HPLC

將預(yù)測(cè)值與HPLC測(cè)定值進(jìn)行樣品配對(duì)t檢驗(yàn)，設(shè)置信水平為95%，雙尾P值為0.191，大于0.05，表明使用HPLC法測(cè)得的槲皮苷含量值與用近紅外光譜法預(yù)測(cè)的含量值差異不明顯，所建立的近紅外定量分析模型可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)桑寄生配方顆粒中的槲皮苷的含量。

3 結(jié)語(yǔ)

采用HPLC法測(cè)定桑寄生配方顆粒中槲皮苷的含量，使用近紅外光譜儀采集桑寄生配方顆粒的近紅外光譜，利用PCA法結(jié)合Hotelling T2方法剔除異常光譜，采用SPXY法劃分出校正集和驗(yàn)證集，利用PLS法確立了桑寄生配方顆粒中槲皮苷含量測(cè)定的定量分析模型。該定量分析模型可快速完成大批量樣本的檢驗(yàn)，有良好的預(yù)測(cè)能力，能夠滿(mǎn)足藥物的快速篩查。有利于各級(jí)藥監(jiān)機(jī)構(gòu)監(jiān)督評(píng)價(jià)各個(gè)廠家生產(chǎn)的桑寄生配方顆粒的質(zhì)量，有助于促進(jìn)廠家生產(chǎn)工藝的規(guī)范化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。