石諾林，倪中亞，袁富文*

1上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，上海 201203；2捷思英達(dá)醫(yī)藥技術(shù)有限公司，上海 201318

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因［1］。雖然聯(lián)合化療的使用大大提高了患者的5年生存率，但約有30%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。重要的是，伴有肺轉(zhuǎn)移的CRC患者的5年生存率極低，為10%～20%［2］。因此，迫切需要新的治療方法。

結(jié)直腸癌歸屬中醫(yī)學(xué)“臟毒”“腸蕈”“腸積”等范疇，主要病機(jī)為痰、濕、淤、毒等因素客于大腸，導(dǎo)致痰濕內(nèi)生，進(jìn)而痰淤互結(jié)，郁而化熱，加之正氣不足，無力驅(qū)邪外出，濕熱淤毒蘊(yùn)結(jié)于腸內(nèi)，淤結(jié)不通，日久變生而成［3］。臭椿皮散（Chouchunpi San，CCPS）出自《太平圣惠方》，由臭椿皮、附子、干姜、雞冠花、槐耳、甘草組成，具有清熱燥濕、收斂止血的功效?，F(xiàn)代研究表明，該方各藥及有效成分具有較好的抗腫瘤作用。臭椿皮中藥具有較好的抗腫瘤活性，可誘導(dǎo)肝癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡、周期阻滯［4-7］，且通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)人黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，具有潛在的抗黑色素瘤活性；雞冠花制劑及其提取物對于多種腫瘤細(xì)胞及荷瘤小鼠瘤塊均有抑制作用［8］；槐耳顆粒聯(lián)合化療藥物可以顯著提高結(jié)直腸癌患者生存期及生活質(zhì)量［9］。

如今，中醫(yī)藥已日益成為一種具有吸引力的新型治療藥物來源，在預(yù)防和治療癌癥方面發(fā)揮了重要作用。研究顯示，中醫(yī)藥對CRC的治療包括預(yù)防腫瘤發(fā)生、降低毒性、提高治療效果、降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［10-11］。此外，長期使用中藥與Ⅱ期和Ⅲ期CRC患者的生存結(jié)局改善有關(guān)［12-14］。中藥復(fù)方成分之間的相互作用機(jī)制復(fù)雜，可以通過多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有系統(tǒng)性和整體性的特點(diǎn)，可從生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度來闡釋疾病與藥物之間的作用關(guān)系［15-17］，為全面闡述臭椿皮散治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析臭椿皮散治療結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)和藥理機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞MC38 和人結(jié)直腸癌細(xì)胞Caco2（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；胎牛血清（Sigma公司，美國）；DMEM 培養(yǎng)基（上海源培生物科技有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液（上海碧云天生物技術(shù)公司）；CCK8 試劑盒（Dojind 公司，日本，貨號(hào)：CK04）；STAT3抗體、p-SAT3抗體（Thermo公司，美國）；GAPDH 抗體（上海賽信通生物試劑有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（上海碧云天生物技術(shù)公司）；玻璃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph公司，德國）；酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）；中藥復(fù)方臭椿皮散由椿皮、干姜、槐耳、雞冠花、甘草、附子組成，均購買于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院門診藥房。

1.2 方法

1.2.1 臭椿皮散活性成分和靶點(diǎn)的收集

通過TCMSP（https：//tcmsp-e.com）數(shù)據(jù)庫和HERB數(shù)據(jù)庫（https：//herb.ac.cn）檢索臭椿皮散相關(guān)中藥，分別以椿皮、干姜、槐耳、雞冠花、甘草、附子為檢索詞，將以上兩個(gè)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)合并得到臭椿皮散復(fù)方的有效成分。根據(jù)每個(gè)成分的pubchem ID在Pubchem 數(shù)據(jù)庫中下載對應(yīng)成分?jǐn)?shù)據(jù)，刪除分子量≥500 kDa 成分，再根據(jù)Lipinsk 原則（miLog≤5、nOHNH≤5、nOH≤10）進(jìn)一步篩選，并最終在Swiss ADME 數(shù)據(jù)庫（www.swissadme.ch）篩選得到臭椿皮散有效成分（“GI absorption”為high，“High、Lipinski、Ghose、Veber、Ean、Megge”至少有3 個(gè)“YES”）。利用SwissTargetPrediciton 數(shù)據(jù)庫（https：//swisstargetprediction.ch）中對各成分的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行查找整合。篩選結(jié)束后，為標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，統(tǒng)一在Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2.2 結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)構(gòu)建

以“Colorectal cancer”為關(guān)鍵詞，分別在Gene-Cards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com）、Pharmgkb 數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org）和TTD 數(shù)據(jù)庫（https：//db.idrblab.net/ttd）中進(jìn)行檢索，獲得的基因集作為疾病靶點(diǎn)，若靶點(diǎn)過多設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)，合并4個(gè)數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到結(jié)直腸癌靶點(diǎn)。將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)輸入到Venn Diagrams（www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html）數(shù)據(jù)庫中獲得交集靶點(diǎn)，制作韋恩圖。

1.2.3 臭椿皮散-結(jié)直腸癌靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)提交到STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）構(gòu)建蛋白互作（protein-protein interaction networks，PPI）網(wǎng)絡(luò)，將生物種類設(shè)置為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”（＞0.9），其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，進(jìn)而得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape（https：//cytoscape.org）內(nèi)置工具分析靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括Degree、Betweenness及Closeness，確認(rèn)網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

1.2.4 GO和KEGG富集分析

為了進(jìn)一步明確臭椿皮散抗結(jié)直腸癌的可能機(jī)制，利用R 語言ClusterProfile 程序包對靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 和GO 富集分析，篩選前10 個(gè)生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和 前30 個(gè)KEGG 通路，將所得結(jié)果進(jìn)行可視化處理，分別以柱形圖和氣泡圖展示結(jié)果。

1.2.5 分子對接

在Pubchem 數(shù) 據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中確定化合物名稱、分子量和3D 結(jié)構(gòu)，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）中下載活性成分所對應(yīng)的3D 結(jié)構(gòu)。利用AutoDockVina 軟件（autodock.scripps.edu）對接配體和蛋白質(zhì)，將目標(biāo)蛋白晶體進(jìn)行去除水分子、加氫處理，將靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)與活性成分進(jìn)行分子對接，利用Vina 進(jìn)行對接，并使用Pymol軟件（https：//www.pymol.org）進(jìn)行可視化。

1.2.6 臭椿皮散水提物的制備

取臭椿皮散稱重，按比例（臭椿皮30 g，干姜15 g，槐耳15 g，雞冠花15 g，甘草9 g，附子9 g）以10倍水加入，在室溫下放置浸泡1 h，回流煎煮1 h，過濾藥液后。再次加入10 倍水回流煎煮1 h，將過濾藥液與之前藥液合并，記錄2 次煎煮的藥液回收量。將藥液進(jìn)行濃縮，將完成濃縮的藥液放置干燥箱中進(jìn)行干燥，48 h后，得藥干凍粉，保存至-80 ℃冰箱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)開始前在無菌條件下稱取適量臭椿皮散粉末，加入PBS并經(jīng)過渦旋、超聲等方式使臭椿皮散粉末完全溶解，用0.22 μm濾器過濾并配制成實(shí)驗(yàn)所需藥物濃度，放置于-20 ℃保存。

1.2.7 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

將臭椿皮散配制成不同的藥物濃度，取對數(shù)生長期MC38、Caco2 細(xì)胞，以1 000 個(gè)/孔接種于96 孔板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)分組每組4 個(gè)復(fù)孔，分別干預(yù)24 h、48 h、72 h，每孔加入含10 μL CCK-8 的培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下避光培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測各孔吸光度（OD值）。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)

根據(jù)臭椿皮散濃度分為空白對照組（0 μg/mL）、低劑量組（125 μg/mL）、中劑量組（250 μg/mL）和高劑量組（500 μg/mL），處理MC38 細(xì)胞24 h。采用FITC 標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-V（annexin-V）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。按照FITC 凋亡檢測試劑盒的操作規(guī)程進(jìn)行染色，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。未經(jīng)PI染色的熒光素陽性細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞，使用Flowjo 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定凋亡細(xì)胞百分比。

1.2.9 劃痕實(shí)驗(yàn)

將結(jié)直腸癌細(xì)胞MC38按上述實(shí)驗(yàn)分組后接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合達(dá)95%以上，用無菌槍頭劃細(xì)胞單層，形成劃痕，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次除去劃下的細(xì)胞碎片，繼續(xù)用含1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別在0 h 和24 h 時(shí)間點(diǎn)于10 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照記錄，通過Image J軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率：（0 h 劃痕距離-24 h 劃痕距離）/0 h 劃痕距離×100%。

1.2.10 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)蛋白

用細(xì)胞裂解液（RIPA裂解液，1%蛋白酶抑制劑和1 mmol/L PMSF）重懸細(xì)胞MC38，4 ℃12 000 r/min離心15 min，取上清，測定蛋白濃度。在蛋白原液中加入5×上樣緩沖液，100 ℃下煮沸15 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），恒流將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h，4 ℃過夜孵育抗體GAPDH（1∶2 000）、STAT3抗體（1∶2 000）和p-STAT3抗體（1∶2 000），TBST洗滌3遍，洗滌后與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，用增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光（ECL）液進(jìn)行曝光，用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)兩組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組件差異采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臭椿皮散活性成分和靶點(diǎn)的獲取

經(jīng)TCMSP 和HERB 數(shù)據(jù)庫共同檢索臭椿皮散各組成的化學(xué)成分，篩選其中椿皮31種、雞冠花5種、槐耳2 種、附子29 種、干姜64、甘草93 種，共檢索出化合物227種。去除重復(fù)成分后共獲得臭椿皮散的有效成分共計(jì)117個(gè)。通過Swisstarget Prediction 數(shù)據(jù)庫篩選各成分的治療靶點(diǎn)共計(jì)7 836 個(gè)，再利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot）對篩選出來的靶點(diǎn)進(jìn)行分析和注釋，轉(zhuǎn)換成基因名并刪除重復(fù)值后，獲得潛在治療靶點(diǎn)共920個(gè)。

2.2 臭椿皮散治療結(jié)直腸癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中以關(guān)鍵詞“colorectal cancer”檢索結(jié)直腸癌靶點(diǎn)，以相關(guān)性得分（relevance score）≥10 位標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Score 大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)，同時(shí)在GrugBank、PharmGKB、TTD 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，幾組數(shù)據(jù)合并，去除重復(fù)值后共獲得疾病靶點(diǎn)9 194個(gè)（圖1A）；將篩選的臭椿皮散活性成分靶點(diǎn)與結(jié)直腸癌靶點(diǎn)取交集，通過繪制韋恩圖，得到臭椿皮散-結(jié)直腸癌共同靶點(diǎn)787個(gè)（圖1B）。

圖1 臭椿皮散治療結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the intersection of CCPS and CRC targets

2.3 中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

利用Cytoscape 軟件構(gòu)建“臭椿皮散-化合物-靶點(diǎn)-結(jié)直腸癌”網(wǎng)絡(luò)（圖2A），臭椿皮散治療結(jié)直腸癌存在多個(gè)化合物作用于同一個(gè)靶點(diǎn)和1個(gè)化合物與多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生作用的現(xiàn)象。通過軟件的分析模塊對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，結(jié)果表明相關(guān)度（degree）排名前5 的 是licochalcone A（MOL000497）、odoratin（MOL005016）、licoricone（MOL004855）、licocoumarone（MOL004882）、quercetin（MOL000098）。在STRING 平臺(tái)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，使用Cytoscape 軟件，以相關(guān)度（degree）≥2 倍中位數(shù)，并且相似度（closeness）和中間性（betweenness）＞中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)對關(guān)鍵基因進(jìn)行分析和篩選，獲得了17個(gè)核心基因（見圖2B、C），結(jié)果分析顯示STAT3在網(wǎng)絡(luò)中的相關(guān)度為13，相似度為0.84，中間性為14.5，預(yù)測STAT3是臭椿皮散治療結(jié)直腸癌的最主要靶點(diǎn)。其余基因?yàn)橄鄬χ匾陌悬c(diǎn)（表1）。

表1 臭椿皮散抗結(jié)直腸癌核心靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)Table 1 Topological parameters of CCPS anti-CRC core targets

圖2 中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析Figure 2 Construction and analysis of TCM-disease regulatory network

2.4 KEGG和GO分析結(jié)果

使用R語言對臭椿皮散治療結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析及GO 功能富集分析。結(jié)果表明多個(gè)靶點(diǎn)的功能與結(jié)直腸癌的發(fā)生密不可分。臭椿皮散主要參與的生物學(xué)過程涉及對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、外來生物刺激反應(yīng)、細(xì)胞穿膜肽反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等過程，參與的通路主要涉及癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等（圖3）。

圖3 臭椿皮散治療結(jié)直腸癌靶點(diǎn)的GO富集分析及KEGG通路分析Figure 3 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis of CCPS treatment target in CRC

2.5 分子對接驗(yàn)證

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的最關(guān)鍵靶點(diǎn)STAT3 與其對應(yīng)的1 個(gè)核心化合物分子licochalcone A（MOL000497）對接后，配體在靶標(biāo)中的位置和作用方式的可視化處理（圖4）。由圖可見，STAT3與licochalcone A結(jié)合能為-5.0 kJ/mol，接著用AutodockVina軟件進(jìn)行受體蛋白-小分子配體評估兩者的結(jié)合能力，當(dāng)結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol時(shí)，認(rèn)為配體可以和受體較好的結(jié)合，并且結(jié)合能力越低，越有利于構(gòu)象的穩(wěn)定。

圖4 STAT3與licochalcone A的對接位置Figure 4 Docking position of STAT3 with licochalcone

2.6 臭椿皮散抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞活性

為明確臭椿皮散對結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用，將MC38 細(xì)胞和Caco2 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的臭椿皮散分別處理24、48和72 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞活性被抑制，且呈一定的濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。為排除臭椿皮散對細(xì)胞的毒性，選擇125 μg/mL、250 μg/mL 和500 μg/mL 3 個(gè)濃度作為低、中、高劑量進(jìn)行下面后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 臭椿皮散抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖Figure 5 Effect of CCPS on CRC cell proliferation

2.7 臭椿皮散促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，臭椿皮散低、中、高劑量組處理MC38細(xì)胞48 h后，明顯促進(jìn)MC38細(xì)胞凋亡，凋亡比例與臭椿皮散濃度成正比（圖6）。

圖6 臭椿皮散促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡Figure 6 CCPS increased apoptosis in CRC cell

2.8 臭椿皮散對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響

臭椿皮散干預(yù)MC38 細(xì)胞24 h 后，與空白對照組相比，劃痕愈合距離明顯減?。≒＜0.05）；隨著臭椿皮散劑量的增加，劃痕愈合距離逐漸減小，臭椿皮散低劑量、中劑量和高劑量組組間比較差異顯著（P＜0.05），表明臭椿皮散能夠抑制MC38 細(xì)胞的遷移能力，并在臭椿皮散低、中和高劑量組呈現(xiàn)劑量依賴性（圖7）。

圖7 臭椿皮散抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移Figure 7 CCPS inhibited CRC cell migration

2.9 臭椿皮散對MC38細(xì)胞STAT3相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的靶點(diǎn)為STAT3，使用低、中、高3 個(gè)濃度的臭椿皮散水提物干預(yù)MC38 細(xì)胞24 h，與空白組比較，3 個(gè)藥物組中p-STAT3 表達(dá)明顯降低；隨著藥物濃度的增加，p-STAT3表達(dá)量逐漸降低，呈現(xiàn)出劑量依賴性（圖8）。

圖8 臭椿皮散干預(yù)后STAT3相關(guān)蛋白表達(dá)情況Figure 8 CCPS suppressed CRC cells by inhibiting STAT3 protein phosphorylation

3 討論

結(jié)直腸癌患者臨床上主要表現(xiàn)為便秘、腹脹、腹痛、腹瀉，嚴(yán)重者出現(xiàn)血便、嘔吐，若腫瘤轉(zhuǎn)移至其他器官還可能出現(xiàn)其他疾病，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和生存時(shí)間。中醫(yī)藥在結(jié)直腸癌診斷治療過程中的優(yōu)勢和特色明顯，具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。臭椿皮散作為臨床上治療結(jié)直腸癌的經(jīng)典中醫(yī)方劑，對其藥理機(jī)制的研究顯得尤為迫切。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，共篩選出117 種潛在藥物成分和787個(gè)共同作用蛋白靶點(diǎn)。在臭椿皮散治療結(jié)直腸癌的核心基因靶點(diǎn)篩選發(fā)現(xiàn)，基因關(guān)聯(lián)程度最高的是STAT3。KEGG 和GO 分析結(jié)果也證明靶點(diǎn)主要與癌癥的多種通路相關(guān)。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，臭椿皮散呈劑量和時(shí)間依賴性抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，且促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞遷移，該抑制作用與其降低STAT3蛋白表達(dá)相關(guān)，提示臭椿皮散可能通過抑制STAT3靶點(diǎn)發(fā)揮對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的抑制效應(yīng)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和STAT6，它們介導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。其中，STAT3 參與了細(xì)胞的增殖、存活、分化和血管生成等多種生物學(xué)過程［18］，與本研究細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。在正常細(xì)胞中，STAT3 的瞬時(shí)激活主要是通過磷酸化將質(zhì)膜上的細(xì)胞因子和生長因子受體的轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳遞到細(xì)胞核［19］。然而，STAT3 在大多數(shù)癌癥中呈過度激活，在患者腫瘤組織來源的樣本中觀察到STAT3 過表達(dá)［20］。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 在惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌以及卵巢癌等多種實(shí)體癌組織中活性增強(qiáng)［21-24］。此外，STAT3還與腫瘤免疫逃逸和腫瘤藥物耐藥性有密切關(guān)系［25-27］，大量證據(jù)支持阻斷STAT3 激活可以作為癌癥和其他疾病的治療靶點(diǎn)。

綜上，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實(shí)驗(yàn)方法，以臭椿皮散為研究對象，探討了其治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制。根據(jù)結(jié)果，選取STAT3靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，但本研究只采用了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，對于通路只考慮了蛋白水平變化，機(jī)制研究尚有不足，今后還需要從在體實(shí)驗(yàn)角度等層面進(jìn)一步開展研究。