李夢(mèng)圓，王宇萌，徐青清，關(guān) 卓，卞成玥，江 飛，張光東

南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院綜合診療科，江蘇省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，口腔醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究中心，江蘇 南京 210029

牙髓炎是口腔常見疾病之一，目前治療牙髓炎的主流方法是摘除病變牙髓組織，行根管治療，但失去牙髓的患牙喪失滋養(yǎng)、感覺、防御、形成功能，會(huì)出現(xiàn)牙冠變色、脆而易折、繼發(fā)齲風(fēng)險(xiǎn)增加［1］。然而，臨床上難以獲得自體健康牙髓組織分離牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cell，DPSC），再通過組織工程策略再生牙髓組織。因此，如何利用病變牙髓組織中DPSC原位促進(jìn)牙髓組織再生成為研究熱點(diǎn)。由于牙髓組織具有較強(qiáng)抗感染及抵抗外界刺激等多種作用［2］，DPSC在病變牙髓組織中依然可以存活并保留一定的再生能力，如何通過干預(yù)手段有效誘導(dǎo)這類再生功能受損的DPSC成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化成為該熱點(diǎn)的具體研究方向。

鈣離子（calcium ion，Ca2+）與DPSC成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化、促進(jìn)牙體硬組織的再生有密切聯(lián)系。據(jù)報(bào)道，促進(jìn)細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，可激活一系列牙/骨向分化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)DPSC 的成牙本質(zhì)向分化［3］。改變牙髓炎組織中DPSC的再生潛能，使之通過向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，參與牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生［4］。α7乙酰膽堿受體（alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor，α7-nAChR）是一種煙堿乙酰膽堿受體，廣泛存在于神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞中，在牙髓細(xì)胞中表達(dá)。它是由5 個(gè)α7 單體組成的同型五聚體，在膽堿能抗炎通路中發(fā)揮重要作用［5］。α7-nAChR 是膽堿能抗炎通路的重要組成部分，α7-nAChR 激動(dòng)劑PNU-282987 能夠抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）和白介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）等多種促炎因子的分泌［6］。同時(shí)，該受體表現(xiàn)出對(duì)Ca2+的高選擇性滲透性，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平進(jìn)行調(diào)控［7］。研究指出，α7-nAChR 參與牙體硬組織形成的初始階段，可能與該受體對(duì)鈣的高滲透性相關(guān)［8］。此外，α7-nAChR在新形成的軟骨內(nèi)和骨髓骨化骨基質(zhì)中表達(dá)強(qiáng)烈［9］，證明其與成骨之間的獨(dú)特聯(lián)系。研究表明，α7-nAChR 抑制劑MLA會(huì)抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+的瞬變，可以使激動(dòng)劑引起的Ca2+內(nèi)流快速衰減，同時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+震蕩的頻率［10］。而該受體的激動(dòng)劑PNU-282987，通過增加α7-nAChR 通道的開啟時(shí)間來加強(qiáng)Ca2+內(nèi)流作用［11］。因此，本研究認(rèn)為，活化α7-nAChR，誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，能夠促進(jìn)再生功能受損的DPSC成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化。

目前已有許多關(guān)于α7-nAChR在炎癥治療中的研究，但是與牙髓炎狀態(tài)下DPSC成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化的研究未有報(bào)道。本研究擬通過分離培養(yǎng)DPSC，大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激DPSC模擬牙髓炎中再生功能受損的DPSC。通過α7-nAChR激動(dòng)劑PNU-282987，活化該受體，驗(yàn)證活化α7-nAChR是否可以促進(jìn)胞外Ca2+內(nèi)流增加，誘導(dǎo)炎癥刺激下DPSC 牙/骨向分化發(fā)揮的作用，為研制新型蓋髓劑用于臨床活髓保存治療提供助益。

1 材料和方法

1.1 材料

PNU-282987（MCE 公司，美國），LPS（Sigma 公司，美國），基礎(chǔ)培養(yǎng)基α-MEM（Gibco 公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco 公司，美國），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，Hyclone公司，美國），青霉素-鏈霉素（Gibco公司，美國），胰蛋白酶（Gibco 公司，美國），Ⅰ型膠原酶（Sigma 公司，美國），SDS-PAGE 凝膠試劑盒（上海碧云天），蛋白Marker（Fermentas 公司，美國），RUNX2 抗體、DSPP 抗體、OSX 抗體、OPN 抗體、COL-I 抗體、ALP 抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Abcam 公司，美國），CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本），堿性磷酸酶染色試劑盒（上海碧云天），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒（南京建成公司），RNA 提取試劑盒（無錫Bioteke），酶標(biāo)儀ELx800（Bio-Tek instruments Inc公司，美國），微孔板分光光度計(jì)（MD公司，美國），茜素紅染液（Sigma公司，美國），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（GE公司，美國），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國），ABI7500 real-time PCR系統(tǒng)（ABI公司，美國）等。

本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)（PJ2022-064-001）。

1.2 方法

1.2.1 DPSC原代培養(yǎng)

選取本院口腔頜面外科根尖未發(fā)育完成的健康的第三磨牙。用含有1%青霉素-鏈霉素的PBS沖洗，無菌條件下取出牙髓，超凈臺(tái)內(nèi)在200 μL α-MEM中剪碎，加入500 μL 3 mg/mL Ⅰ型膠原酶和200 μL 4 mg/mL 胰酶，在37 ℃、5% CO2條件下孵育消化20 min。加入完全培養(yǎng)基，即含有10%FBS的α-MEM終止消化。牙髓組織塊懸液在1 000 r/min 離心5 min后，接種于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3 d換液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。本實(shí)驗(yàn)采用生長狀態(tài)良好的第3代DPSC。

1.2.2 DPSC的表面標(biāo)志物鑒定

將DPSC用胰蛋白酶消化，經(jīng)過離心重懸后，稀釋細(xì)胞，置于EP管內(nèi)。各管中分別加入熒光標(biāo)記抗體CD90、CD73、CD105、CD34、CD146，空白對(duì)照組僅余細(xì)胞懸液。4 ℃條件下避光孵育1 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS漂洗，重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

以2 000 個(gè)/孔的密度在96 孔板中鋪DPSC。用CCK-8試劑檢測(cè)PNU-282987和Ca2+對(duì)DPSC增殖的影響。PNU-282987 的濃度梯度為0、0.1、1.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μmol/L，CaCl2的濃度梯度為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。用CCK-8試劑于第0、1、3、5、7天，37 ℃5%CO2條件下孵育2 h，450 nm波長下測(cè)定吸光度。

1.2.4 ALP染色及ALP活性測(cè)定

將DPSC 置于含10 mmol/L β-甘油酸磷酸鈉、50 μmol/L磷酸抗壞血酸和10 nmol/L地塞米松的完全培養(yǎng)基即成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入所需濃度的藥物后，每2～3 d換液，直至第7天。4%的多聚甲醛固定30 min，ALP染色試劑盒配制染色液，在37 ℃下染色5～30 min，ddH2O 終止，掃描儀及顯微鏡觀察。與此類似，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后，用含1%蛋白酶抑制劑PMSF 的RIPA 裂解液裂解DPSC，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，配制檢測(cè)液，520 nm波長處測(cè)定吸光度。

1.2.5 RT-qPCR

DPSC用LPS誘導(dǎo)后，分為對(duì)照組、PNU-282987、CaCl2、PNU-282987+CaCl24組。細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，根據(jù)說明書用RNA提取試劑盒提取各組總RNA，然后使用PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見表1。以人GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較各組間基因表達(dá)情況。

表1 RT-qPCR使用引物序列Table 1 Primer sequences in RT-qPCR

1.2.6 免疫印跡分析

DPSC用LPS誘導(dǎo)后，分為對(duì)照組、PNU-282987、CaCl2、PNU-282987+CaCl24 組，用含有相應(yīng)藥物的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d 后，用1%PMSF 的RIPA 裂解細(xì)胞，超聲振蕩后，10 000 r/min 4 ℃下離心15 min，提取細(xì)胞總蛋白。制備10%分離膠、4%濃縮膠、電泳緩沖液和轉(zhuǎn)膜液。每個(gè)泳道加入等量蛋白，60 V恒壓電泳用于濃縮膠，90 V恒壓電泳用于分離膠。轉(zhuǎn)膜前用甲醇浸泡PVDF膜30 s，使其活化，將膜對(duì)準(zhǔn)蓋上膠，放入電轉(zhuǎn)儀，300 mA恒流電轉(zhuǎn)。含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液在搖床上緩振搖2 h封閉，再將膜封入1∶1 000稀釋好的一抗，4 ℃冰箱過夜。次日，洗膜后將膜放入配制好的二抗（1∶2 500），室溫下慢搖1 h。最后，對(duì)膜進(jìn)行曝光成像，Image J軟件定量分析。

1.2.7 茜素紅染色和氯代十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride，CPC）定量

DPSC用LPS誘導(dǎo)后，分為對(duì)照組、PNU-282987、CaCl2、PNU-282987+CaCl2組，加入含相應(yīng)濃度藥物的礦化誘導(dǎo)液，2～3 d 進(jìn)行1 次換液，培養(yǎng)2 周后，PBS 洗3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入茜素紅染色液，室溫孵育10～30 min，ddH2O 洗，在掃描儀及顯微鏡下采集圖片。在茜素紅染色的孔板內(nèi)，將配制的10%CPC 加入孔板中溶解鈣結(jié)節(jié)，置于搖床上孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm各孔的吸光度。

1.2.8 Fura-2 AM測(cè)定DPSC內(nèi)Ca2+濃度

用PBS 將Fura-2 AM 稀釋成5 μmol/L 的工作液，去培養(yǎng)基，使用緩沖液洗滌細(xì)胞3 次；將Fura-2 AM工作液加入細(xì)胞；在37 ℃培養(yǎng)箱孵育30～60 min，用PBS洗3次除去Fura-2 AM工作液，分別加入PNU-282987、CaCl2、PNU-282987+CaCl2，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。運(yùn)用GraphPad Prism8 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組間的差異使用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。對(duì)于兩組以上的比較，使用Tukey’s 或Dunnett’s 事后檢驗(yàn)的單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPSC的分離與培養(yǎng)

取年輕恒牙的牙髓，酶消化法提取原代細(xì)胞，在3 d 后觀察到貼壁細(xì)胞從組織塊中爬出（圖1A），傳代后的第1代細(xì)胞呈長梭形排列（圖1B）。

圖1 DPSC的細(xì)胞形態(tài)（×100）Figure 1 Morphology of DPSC（×100）

2.2 DPSC的鑒定

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，DPSC 表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD73、CD90、CD146、CD105（99.9%、99.9%、57.2%、99.9%），而造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34表達(dá)陰性（0.13%，圖2），證明成功提取DPSC。

圖2 DPSC表面抗原鑒定結(jié)果Figure 2 Surface antigen identification results of DPSC

2.3 CCK-8檢測(cè)DPSC增殖

CCK-8 結(jié)果顯示，當(dāng)PNU-282987 濃度低于10 μmol/L（圖3A），CaCl2濃度低于2 mmol/L對(duì)DPSC細(xì)胞增殖無影響（圖3B）。

圖3 CCK-8檢測(cè)不同濃度下PNU-282987（A）和Ca2+（B）對(duì)DPSC增殖的影響Figure 3 The effects of different concentration of PNU-282987（A）and Ca2+（B）on the proliferation of DPSC as detected by the CCK-8

2.4 篩選PNU-282987的最佳礦化誘導(dǎo)濃度

調(diào)整濃度梯度后，在DPSC中分別加入10 μg/mL LPS，ALP 染色（圖4A）和ALP 活性（圖4B）實(shí)驗(yàn)證明，篩選出在此條件下PNU-282987 促進(jìn)DPSC ALP表達(dá)的最佳濃度為10 μmol/L。

圖4 不同濃度PNU-282987作用于LPS刺激的DPSC時(shí)ALP表達(dá)的變化（×40）Figure 4 Changes of ALP expression in DPSC stimulated by LPS treated with different concentrations of PNU-282987（×40）

2.5 活化α7-nAChR 聯(lián)合Ca2+對(duì)炎癥環(huán)境下DPSC牙/骨向分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)成骨誘導(dǎo)后炎癥的DPSC各組細(xì)胞中與成牙本質(zhì)分化和成骨分化相關(guān)的蛋白（COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX）的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PNU-282987、CaCl2、PNU-282987+CaCl2組相關(guān)蛋白COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX表達(dá)均升高，其中PNU-282987和CaCl2聯(lián)合后促進(jìn)牙/骨向分化的效果提高最顯著（圖5）。

圖5 活化α7-nAChR聯(lián)合Ca2+對(duì)LPS刺激的DPSC牙/骨向分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects ofactivation of α7-nAChR combined with Ca2+on the expression of odontogenic/osteogenic related proteins in DPSCs stimulated by LPS

2.6 活化α7-nAChR 聯(lián)合Ca2+對(duì)炎癥環(huán)境下DPSC牙/骨向分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測(cè)成骨誘導(dǎo)后炎癥的DPSC各組細(xì)胞中與成牙本質(zhì)分化和成骨分化相關(guān)的基因（COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX）的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PNU-282987、CaCl2和PNU-282987+CaCl2組牙/骨向分化相關(guān)基因表達(dá)升高，其中PNU-282987+CaCl2最高（圖6）。

圖6 活化α7-nAChR聯(lián)合Ca2+對(duì)炎癥環(huán)境下DPSC牙/骨向分化相關(guān)基因表達(dá)的影響Figure 6 Effects of activation of α7-nAChR combined with Ca2+ on the expression of odontogenic/osteogenic related genes in DPSC under inflammatory conditions

2.7 活化α7-nAChR 聯(lián)合Ca2+對(duì)炎癥環(huán)境下DPSC礦化基質(zhì)形成能力的影響

茜素紅染色結(jié)果顯示，PNU-282987+CaCl2組、PNU-282987 組、Ca2+染色程度均較對(duì)照組深，且PNU-282987+CaCl2組染色最深，礦化結(jié)節(jié)更明顯。10%CPC定量檢測(cè)Ca2+含量結(jié)果與染色結(jié)果一致（圖7）。

圖7 活化α7-nAChR聯(lián)合Ca2+對(duì)炎癥環(huán)境下DPSC礦化基質(zhì)形成能力的影響（×40）Figure 7 Effect of activationof α7-nAChR combined with Ca2+ on the mineralization matrix formation capacity of DPSC under inflammatory conditions（×40）

2.8 活化α7-nAChR 聯(lián)合細(xì)胞外Ca2+促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高

本研究加入PNU-282987、CaCl2以及PNU-282987+CaCl2到炎癥DPSC后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光信號(hào)的變化。在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，PNU-282987組及細(xì)胞外Ca2+組熒光強(qiáng)度增加，Ca2+內(nèi)流增多，二者聯(lián)合后，Ca2+內(nèi)流最明顯（圖8）。

圖8 PNU-282987及細(xì)胞外Ca2+對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響（×400）Figure 8 Effects of PNU-282987 and extracellular Ca2+on intracellular Ca2+concentration（×400）

3 討論

LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的成分，廣泛用于體外實(shí)驗(yàn)中模擬炎癥環(huán)境刺激DPSC，獲得分化功能受損的DPSC 炎癥反應(yīng)［12］。已有研究證明，大腸桿菌來源的LPS顯著減少了DPSC中的礦化物質(zhì)沉積，降低了DPSC 的功能分化［13］，因此本研究參考文獻(xiàn)中實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇10 μg/mL 大腸桿菌來源LPS，構(gòu)建DPSC的體外炎癥模型。

α7-nAChR 是一種神經(jīng)遞質(zhì)受體，廣泛存在于各種非神經(jīng)組織中，Wang 等［14］研究發(fā)現(xiàn)DPSC 表達(dá)α7-nAChR，且炎癥牙髓組織α7-nAChR 的mRNA和蛋白水平明顯較正常牙髓組織高。研究表明，非神經(jīng)元膽堿能系統(tǒng)表達(dá)α7-nAchR在成骨細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮積極作用，且α7-nAchR 缺失可能會(huì)導(dǎo)致小鼠軟骨退化［15］。同時(shí)研究指出，活化α7-nAChR有助于成骨進(jìn)程，其激動(dòng)劑處理后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，礦化進(jìn)程加快［16］。這些研究表明了α7-nAChR在DPSC中表達(dá)，并在牙/骨向分化過程中發(fā)揮重要作用。PNU-282987 是一種α7-nAChR 的激動(dòng)劑，可以使α7-nAChR 通道打開時(shí)間增加，但不影響其蛋白和mRNA表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，激活了鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）信號(hào)通路，從而改善細(xì)胞內(nèi)Ca2+流動(dòng)狀態(tài)，使牙/骨向分化基因表達(dá)增加［17］。同時(shí)，研究顯示α7-nAChR 的活化能夠抑制炎癥小體激活，降低炎癥因子分泌［18］，也能緩解慢性炎癥性疾病的癥狀，促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)［19］，由此可見，PNU-282987促進(jìn)DPSCs 牙/骨向分化的另一可能原因?yàn)橐种屏薒PS 對(duì)DPSC 炎癥因子分泌的影響，促進(jìn)DPSC 的功能恢復(fù)。本研究通過ALP 染色、ALP 活性、Western blot、RT-qPCR 及茜素紅實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PNU-282987 可以通過活化α7-nAChR使細(xì)胞ALP表達(dá)及牙/骨向分化相關(guān)基因和蛋白，PNU-282987 是否存在抗炎、促進(jìn)成骨的雙重作用仍需進(jìn)一步探究。

當(dāng)牙髓發(fā)生暴露時(shí)，直接蓋髓后保留牙髓活力無疑是最好的選擇。最理想的蓋髓劑應(yīng)具有生物相容性、抗菌性、機(jī)械強(qiáng)度、封閉性并刺激硬組織屏障的產(chǎn)生、促進(jìn)組織修復(fù)。目前最常用的蓋髓劑多含有Ca2+，其為鈣元素在化合物中的存在形式，能夠維持正常細(xì)胞膜電位及細(xì)胞正常電傳導(dǎo)。研究表明，細(xì)胞外Ca2+水平升高導(dǎo)致DPSC通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶A 系統(tǒng)增加成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)，這種機(jī)制有助于設(shè)計(jì)牙本質(zhì)的再生療法［20］。而當(dāng)細(xì)胞外液Ca2+濃度較高，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較低時(shí)，細(xì)胞膜Ca2+通道開放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，能夠促進(jìn)DPSC 的成牙細(xì)胞分化，這可能是開發(fā)牙髓修復(fù)有效保守治療的潛在靶點(diǎn)［21］。依此結(jié)論，提高細(xì)胞外Ca2+濃度，同時(shí)找到促進(jìn)Ca2+內(nèi)流的策略可以更好地促進(jìn)DPSC成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化，α7-nAChR作為調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+流的關(guān)鍵分子，活化該受體或可成為實(shí)踐這一策略的有效途徑。

本研究證明了PNU-282987 聯(lián)合Ca2+發(fā)揮出較其單獨(dú)使用更大的潛力，促進(jìn)了DPSC 牙/骨向分化相關(guān)標(biāo)志物mRNA 和蛋白的表達(dá)（COL-I/COL-I、DSPP/DSPP、OPN/OPN、ALP/ALP、RUNX2/RUNX2、OSX/OSX），上述標(biāo)志物中，COL-I是成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)形成的指標(biāo)，可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)合；DSPP可啟動(dòng)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分實(shí)現(xiàn)Ca2+結(jié)合，促進(jìn)牙本質(zhì)基質(zhì)膠原蛋白的初始礦化；OPN是實(shí)現(xiàn)骨和牙本質(zhì)礦化能力的主要非膠原蛋白；ALP為早期成骨標(biāo)志，ALP的定量檢測(cè)可以反映成骨細(xì)胞的分化水平；RUNX2表達(dá)于創(chuàng)傷愈合早期，是成骨過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子；OSX對(duì)于成骨細(xì)胞的成熟以及膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化至關(guān)重要［22-23］。綜上，通過檢測(cè)上述牙/骨向分化的相關(guān)指標(biāo)，說明PNU-282987及細(xì)胞外Ca2+可以促進(jìn)DPSC的牙/骨向分化能力。Fura-2 AM檢測(cè)提示其分子機(jī)制可能為PNU-282987活化α7-nAChR，使Ca2+從細(xì)胞外流入細(xì)胞增多，增加了成牙本質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)，促進(jìn)了DPSC的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和礦化。

研究表明，細(xì)胞外Ca2+可能一定程度上增強(qiáng)α7-nAChR的作用，增強(qiáng)表現(xiàn)為通道打開頻率的增加以及打開的平均持續(xù)時(shí)間的增加，從而增加細(xì)胞興奮性并增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+［24］，Ca2+在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有積極作用，本研究用PNU-282987 活化α7-nAChR同時(shí)促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，達(dá)到了更佳的促進(jìn)牙/骨向分化效果。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+濃度≥10 mmol/L 會(huì)導(dǎo)致大量的受體通道阻滯，本研究所用的濃度為2 mmol/L，遠(yuǎn)低于此濃度［25］。也有研究證實(shí)，尼古丁激活α7-nAChR會(huì)增加血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+，啟動(dòng)礦化進(jìn)程，導(dǎo)致鈣化形成，RUNX2、OSX和OPN表達(dá)明顯增加［16］，與本研究的結(jié)果類似。

本研究結(jié)果初步證實(shí)通過PNU-282987 活化α7-nAChR 促進(jìn)Ca2+流入細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，誘導(dǎo)炎癥環(huán)境下DPSC 成牙本質(zhì)向分化，為有效恢復(fù)感染牙髓組織再生功能和牙體組織再生提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。