馬萌萌，包天平，曹林霞，李靖燕，余冰睿，田兆方

南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院新生兒科，淮安市小兒呼吸診療重點實驗室，江蘇 淮安 223300

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產兒常見的一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，在出生胎齡＜29周的新生兒中發(fā)病率高達45%［1-2］。BPD的發(fā)病機制目前仍未明確，其主要的病理學特點包括肺泡破壞、纖維化、微血管發(fā)育異常以及氣道損害［3］，其中肺纖維化是BPD 的主要病理特征。在高氧誘導的BPD 模型中，肺泡的發(fā)育、修復和再生受到成纖維細胞的影響，從而導致細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的重塑及纖維化的發(fā)展，導致肺部纖維化進一步加重［4］。目前，對于這種長期存在的慢性呼吸道疾病，既不能預防也不能有效治療，因此尋找BPD的特效藥十分重要。

隱丹參酮（cryptotanshinone，CTS）是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取的一種活性成分，其生物學活性豐富，具有抗炎［5］、抗纖維化［6］、抗腫瘤［7］及神經保護［8］等作用。近期研究表明，CTS 可以通過逆轉上皮間充質轉化［9］、抑制Smad及STAT3通路［10］來改善博來霉素誘導的肺纖維化，但在高氧誘導的肺損傷纖維化中，尚無相關報道，本研究利用高氧誘導新生鼠BPD 模型及體外人胚肺成纖維細胞培養(yǎng)模型，旨在探討CTS在高氧引致的肺纖維化中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

CTS（純度≥98%，批號HY-NO174，MCE 公司，美國）；α-SMA、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3（Abcam 公 司，英 國）；p-Smad3（批號9520T，CST公司，美國）；GAPDH（批號6004-1-ig，武漢三鷹Proteintech 公司）；Ham’s F-12K 培養(yǎng)基（批號A211013，上海BasalMedia公司）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、ECL 發(fā)光液（蘇州新賽美生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應試劑盒、CCK-8 溶液（批號分別為PE5402、PC5902、PC001，南京Proteinbio公司）。

CY-12c 型測氧儀（杭州佳長電子科技有限公司）；LightCyclePCR 儀（Roche 公司，美國）；酶標儀（BioTek公司，美國）；電泳儀、凝膠成像儀（BIO-RAD公司，美國）。

人胚肺成纖維細胞（HFL-1）購于無錫欣潤生物科技有限公司，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的Ham’s F-12K 培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。SD 大鼠［生產許可證編號SCXK（京）2019-0010］飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院，選取12周齡的SD大鼠按雄雌比例1∶3進行合籠，待所有孕鼠自然分娩后選取24 h 內雄性SD 大鼠用。本研究已獲得南京醫(yī)科大學附屬淮安一院倫理委員會批準（倫理編號：DW-P-2023-001-10）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模

新生SD雄性大鼠隨機分為5組，每組8只，分別為空氣組、高氧組、CTS 低劑量組（7.5 mg/kg）、CTS中劑量組（15 mg/kg）及CTS 高劑量組（30 mg/kg）。高氧組及CTS 干預組連續(xù)吸入95%O27 d，空氣組置于室內環(huán)境（21%O2）中7 d。每日8：30—9：30開箱操作，CTS溶于DMSO中進行腹腔注射，高氧組及空氣組同時注射等量的DMSO。氧濃度分析儀連續(xù)監(jiān)測箱內氧氣濃度，并放置鈉石灰吸收老鼠呼出的CO2，哺乳鼠每日在高氧和空氣環(huán)境之間交換，以防止母鼠不耐受高氧出現(xiàn)死亡情況。7 d后對全部鼠實施安樂死，立即取左肺上葉用4%多聚甲醛固定供）蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）和馬松（Masson）染色實驗用，剩余肺組織置于-80 ℃冰箱中待測。

1.2.2 肺組織病理學檢測

左肺上葉用4%多聚甲醛固定過夜后包埋在蠟塊中，切成4 μm厚的連續(xù)切片，之后在室溫條件下進行HE染色以及Masson染色。根據HE染色情況，每張切片隨機選取6個視野，取平均值計算輻射肺泡狀計數(shù)（radical alveolar counts，RAC），并根據Masson染色結果參考文獻［11-12］進行纖維化評分。

1.2.3 RT-qPCR

提取肺組織總RNA 后，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，按照聚合酶鏈反應試劑盒說明加入2×SYBR qPCR Mix 12.5 μL、cDNA 1 μL、前引物（10 μmol/L）0.5 μL 和后引物（10 μmol/L）0.5 μL，最后ddH2O定容至25 μL后在實時熒光定量PCR儀器上進行PCR 擴增。引物序列為：TGF-β1 F：5′-CCTGGACACACAGTACAGCA-3′；TGF-β1 R：5′-CCACGTAGTAGACGATGGGC-3′；α-SMA F：5′-CATCCGACCTTGCTAACGGA-3′；α-SMA R：5′-CCACATACATGGCAGGGACA-3′。

1.2.4 HFL-1細胞分組及處理

取對數(shù)生長期的HFL-1 細胞分為3 組，即空氣組、高氧組及CTS干預組，均勻鋪于6孔板，細胞饑餓12 h后干預組予CTS 10 μmol/L處理，高氧及空氣組加入等量的溶劑DMSO，隨后高氧組及CTS干預組置于95%O2、5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.5 CCK-8測定HFL-1細胞活力

HFL-1細胞以5×104個/mL的密度均勻鋪于96孔板，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，將不同濃度溶于DMSO的CTS（0、2.5、5.0、10.0 μmol/L）處理細胞24 h，之后每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液繼續(xù)孵育2 h，使用酶標儀在450 nm處測量每個孔的吸光度值，每孔設4個復孔取平均值，重復實驗3次。

1.2.6 Western blot

提取各組新生SD 鼠肺組織及HFL-1 細胞的總蛋白，使用BCA法測定總濃度，然后在SDS-PAGE凝膠電泳中分離蛋白質樣品并濕轉到PVDF 膜上，之后脫脂牛奶溶液封閉1 h 后與以下一抗4 ℃孵育過夜：α-SMA（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）、Smad2（1∶500）、p-Smad2（1∶2 000）、Smad3（1∶1 000）、p-Smad3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）。TBST 洗膜后與二抗室溫孵育1 h，最后使用超強發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)進行曝光Image J 軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據采用統(tǒng)計軟件SPSS 27.0進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析比較各組數(shù)據，LSD-t檢驗進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CTS對新生SD大鼠肺組織病理學影響

HE染色顯示高氧組較空氣組肺泡結構紊亂，肺泡形態(tài)變大，數(shù)目減少，RAC值下降（P＜0.05）；不同劑量的CTS干預后肺泡形態(tài)好轉，RAC值也較高氧組明顯上升（P＜0.05，圖1）。

圖1 SD新生大鼠肺組織HE染色（×100）Figure 1 HE staining of lung tissue from neonatal SD rats（×100）

Masson 染色結果顯示，與空氣對照組相比，高氧組膠原纖維含量明顯上升，肺泡排列不規(guī)則，肺泡間隔增厚。CTS 干預后纖維化評分較高氧組降低，其中高劑量的CTS 效果最好（P＜0.05，圖2）。

圖2 SD新生大鼠肺組織Masson染色（×200）Figure 2 Masson staining of lung tissue from neonatal SD rat（×200）

2.2 CTS 對SD 新生大鼠肺組織中TGF-β1 及α-SMA mRNA水平影響

模型組SD 新生大鼠肺中TGF-β1（圖3A）及α-SMA（圖3B）的mRNA表達水平較空氣組明顯升高，不同劑量的CTS 干預后逐漸好轉，較高氧組明顯下降（P＜0.05）。

圖3 各組新生SD 大鼠肺組織中TGF-β1 及α-SMA 的mRNA 表達水平Figure 3 mRNA expression levels of TGF-β1 and α-SMA in neonatal SD rats lung tissue in each group

2.3 CTS 對SD 新生大鼠肺組織中Smad2/3 通路蛋白表達的影響

Western blot 檢測結果顯示高氧暴露后，模型組的p-Smad2/Smad2 蛋白水平較空氣對照組明顯升高（P＜0.05，圖4A、B），p-Smad3/Smad3 在高氧組明顯上升（P＜0.05，圖4A、C），p-Smad2/Smad2及p-Smad3/Smad3比值在CTS處理后呈劑量依賴方式降低（P＜0.05）。

圖4 新生SD大鼠肺組織Smad2/3通路蛋白表達情況Figure 4 Smad2/3 pathway protein expression in lung tissue of neonatal SD rats

2.4 CTS對體外HFL-1增殖活力的影響

體外研究中，首先用不同濃度CTS（2.5、5.0、10.0 mmol/L）處理HFL-1細胞后，細胞的增殖活力均在95%以上，其中CTS 10.0 μmol/L 以內各組與對照組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，圖5A），提示10 μmol/L濃度以內的CTS不影響細胞增殖，故選用10 μmol/L的CTS 用于后續(xù)實驗。在高氧條件下，細胞增殖活力受到影響，高氧組較空氣組下降，但CTS處理后可以提高細胞活力（P＜0.05，圖5B）。

圖5 CTS通過激活TGF-β/Smad信號通路降低高氧下HFL-1細胞的α-SMA水平，提高HFL-1細胞活力Figure 5 CTS reduced α-SMA levels by activating TGF-β/Smad signalling pathway and improved viability of HFL-1 cells

2.5 CTS 對HFL-1 細胞α-SMA 及TGF-β/Smad 通路蛋白表達的影響

體外實驗中，高氧誘導HFL-1細胞后，細胞內的α-SMA 表達明顯上升，在CTS 處理后表達下降（P＜0.05，圖5C、D）。在TGF-β1/Smad 通路蛋白表達中，高氧組與空氣組相比，TGF-β1及Smad2/3磷酸化蛋白含量上升，CTS組較高氧組明顯下降（P＜0.05，圖5C，E～G）。

3 討論

BPD 不僅是一種局部的肺部疾病，也是一種全身性疾病，對患兒成年以后的健康和生活質量具有一定影響［13-15］，隨著目前醫(yī)療水平的提高，BPD的生存率雖然提高了，但不幸的是其發(fā)生率仍然居高不下［16］，且目前仍然沒有特效治療藥物，因此BPD 在新生兒呼吸系統(tǒng)疾病中一直備受關注。CTS是一種從傳統(tǒng)中藥丹參中提取的一種天然化合物，其生物學活性豐富，在多種疾病中具有潛在的治療價值［17］，本研究主要探索CTS 在BPD 相關纖維化中是否發(fā)揮作用。

纖維化作為BPD 的主要病理特征在BPD 的發(fā)展中占據重要地位，在肺部發(fā)育中，成纖維細胞可維持肺泡和支氣管的完整性，但在高氧誘導之后會發(fā)生顯著的形態(tài)學變化［18-19］，可進一步分化為肌成纖維細胞，使得肺泡上皮-間充質信號轉導被破壞，不能正常維持上皮細胞的生長和分化，導致肺部出現(xiàn)異常修復并最終出現(xiàn)纖維化［20-21］。目前，高氧在BPD 發(fā)展中的作用已在實驗模型和臨床試驗中得到證實，高氧誘導的BPD實驗動物模型已經被廣泛運用［22］，本研究通過高氧BPD模型發(fā)現(xiàn)，CTS改善了BPD 模型新生大鼠的肺部病理情況，特別是纖維化現(xiàn)象，體內外結果均顯示纖維化標志物α-SMA的水平降低，提示CTS 可改善高氧誘導的肺纖維化從而起到肺部保護作用。

生長因子TGF-β被認為是肺發(fā)育異常的主要調節(jié)因子，通過TGF-β/Smad2/3 的典型信號轉導調節(jié)早期肺發(fā)育［23-24］，該通路與異常肺泡化關系密切，TGF-β1還可誘導成纖維細胞遷移、肌成纖維細胞的增殖和分化以及ECM的沉積［25］，目前TGF-β靶基因越來越被認為是BPD 的致病因素［26］。TGF-β1 啟動了成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，并導致標志性蛋白α-SMA的顯著增加［27］，這表明抑制纖維化細胞因子TGF-β1 和靶向TGF-β信號通路是BPD 中纖維化治療的潛在策略。本研究結果顯示CTS可以降低高氧后肺組織及HFL-1中的TGF-β1水平，同時降低下游Smad2/3 的磷酸化表達含量，表明CTS 可能通過TGF-β1/Smad 通路在BPD 模型中發(fā)揮抗纖維化的作用。

綜上所述，CTS 對高氧誘導肺損傷的BPD 模型具有保護作用，降低纖維化標志物α-SMA 的水平，其機制可能與TGF-β1/Smad 通路有關，具體上下游的機制有待進一步研究。