王藝霖,劉文星,黃曉強(qiáng),黎崇裕,鐘秋萍,黃東暉,許小澤

(1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,廣東 廣州 510000;2.珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,廣東 珠海 519000)

2型糖尿病是由于胰島素分泌缺陷和(或)胰島素抵抗引起的以長期高血糖并伴有多個(gè)靶器官損害為臨床特點(diǎn)的慢性代謝性疾病[1]。代謝組學(xué)是對低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性與定量分析的一門學(xué)科[2],能夠闡明生物體代謝過程,目前在糖尿病等疾病的研究中廣泛應(yīng)用[3]。2型糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇,其發(fā)生以氣陰兩虛為本,燥熱津傷為標(biāo),氣陰兩虛證為臨床中常見的證型。益氣甘露方由《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》之玉液湯加減化裁而成,以益氣養(yǎng)陰清熱為主。本研究應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù),以2型糖尿病氣陰兩虛證患者為研究對象,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對益氣甘露方治療前后血清代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測,比較其內(nèi)源性物質(zhì)的差異及變化,本研究結(jié)果可為中醫(yī)藥治療2型糖尿病的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年7月—2023年10月于廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院門診及住院部診斷為2型糖尿病氣陰兩虛證患者80例作為研究對象。其中,男46例,女34例;年齡 21～71歲,平均(45.62±10.95)歲 。將患者隨機(jī)分為對照組與試驗(yàn)組,每組40例。兩組患者在年齡、病程、空腹血糖、餐后2 h血糖、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、腰圍、體質(zhì)量方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。此外,從體檢人員中選取了40名與糖尿病患者年齡、性別相匹配的健康人作為健康對照組,其中,男23名,女17名;年齡 20～71歲,平均(43.25±10.16)歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國2型糖尿病防治指南》[4],中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2002年國家衛(wèi)生部《中藥新藥治療消渴病(糖尿病)臨床研究指導(dǎo)原則》中2型糖尿病氣陰兩虛證辨證標(biāo)準(zhǔn):咽干口燥,倦怠乏力。次證:多食易饑,口渴喜飲,氣短懶言,五心煩熱,心悸失眠。舌脈:舌紅少津液,苔薄或花剝,脈細(xì)數(shù)無力,或細(xì)而弦。具備2項(xiàng)主癥和1～2項(xiàng)次癥即可診斷。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

患者年齡18～75周歲;符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),空腹血糖<10 mmol/L,經(jīng)2位主任醫(yī)師按照上述2型糖尿病中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格辨證后,確定診斷為氣陰兩虛證者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

合并有心、腦、肝等嚴(yán)重疾病,或者對研究中某種藥物過敏及無法耐受的患者;妊娠期或哺乳期的婦女;近1個(gè)月內(nèi)發(fā)生過糖尿病急性并發(fā)癥患者;對研究中某種藥物過敏、無法耐受者。

1.5 健康對照組選擇標(biāo)準(zhǔn)

參與研究的健康人年齡18～75周歲;排除糖尿病、IGT、IFG史,無心腦血管、肝、腎疾病。

1.6 脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn)

受試者依從性較差,不能按規(guī)定服藥,或資料不全影響療效評價(jià)者;研究過程中發(fā)生嚴(yán)重不良事件者。

1.7 治療方法

入組患者均在飲食、運(yùn)動控制的基礎(chǔ)上進(jìn)行治,囑患者戒煙、戒酒。對照組:給予二甲雙胍(國藥準(zhǔn)字:H20010716,拜耳醫(yī)藥保健有限公司,)口服治療,0.1 g/次,3次/d,療程為12周。試驗(yàn)組給予益氣甘露方(組成:黃芪15 g,西洋參5 g,天花粉15 g,山藥15 g,山萸肉10 g,葛根15 g,翻白草15 g,烏梅10 g,雞內(nèi)金10 g,麥冬10 g,炙甘草3 g)治療,1劑/d,水煎取汁300 mL,早晚兩次溫服,療程為12周。

1.8 觀察指標(biāo)及療效標(biāo)準(zhǔn)

1.8.1 療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[5]相關(guān)療效的判定原則。

1.8.2 生化指標(biāo)檢測

采用生化儀檢測治療前后的血糖指標(biāo):空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 h PG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、空腹胰島素(INS)、餐后2 h胰島素(INS120′);血脂指標(biāo):總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.8.3 中醫(yī)癥狀積分

觀察治療前、完成治療后中醫(yī)癥狀積分:倦怠乏力、咽干口燥、多食易饑、口渴喜飲、五心煩熱、大便干燥的改變情況,分為無、輕、中、重,分別賦 0 分、1分、2分、3分,分?jǐn)?shù)越高代表癥狀越嚴(yán)重。

1.8.4 代謝組學(xué)檢測

1) 標(biāo)本采集:收集全血至真空采血管,靜置30 min左右,4 ℃,≤1 300 g 離心10 min。待血細(xì)胞完全沉降到管底后,用移液器將上層血清轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管內(nèi),每管200 μL,然后凍存于-80 ℃冰箱。

2) 樣品前處理:吸取100 μL液體樣本于1.5 mL離心管中,在其中加入約400 μL提取液(V(乙腈)∶V(甲醇)=1∶1)含0.02 mg/mL的內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸),渦旋混勻30 s后,低溫超聲提取30 min,把樣品于-20 ℃靜置30 min。4 ℃,13 000 g離心15 min,移取上清液,氮?dú)獯蹈?100 μL復(fù)溶液(V(乙腈)∶V(水)=1∶1)復(fù)溶,低溫超聲萃取5 min(5 ℃,40 kHz),4 ℃,13 000 g離心10 min,移取上清液,上機(jī)分析。

3) 氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-ToF/MS) 分析:采用超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜UHPLC-Q Exactive HF-X系統(tǒng)對樣本進(jìn)行LC-MS/MS分析。

4)物質(zhì)鑒定及分析:上機(jī)后,將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時(shí)間校正、峰對齊,最終得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣,同時(shí)將質(zhì)譜信息與代謝公共數(shù)據(jù)庫相互匹配,從而得到代謝物的相關(guān)信息。

對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)矩陣采用Simca-p軟件,進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交最小偏二乘判別分析分析(OPLS-DA)。顯著差異代謝物的選擇基于OPLS-DA模型得到的變量權(quán)重值(VIP)和t檢驗(yàn)P值來確定,根據(jù)VIP>1、P<0.05兩個(gè)條件判定代謝物為顯著差異性代謝物。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床療效

本研究結(jié)果顯示,對照組臨床療效總有效率為87.50 %,試驗(yàn)組臨床療效總有效率為92.50 %,兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且試驗(yàn)組不低于對照組。見表1。

表1 兩組患者臨床療效

2.2 兩組患者血糖相關(guān)指標(biāo)

本研究結(jié)果顯示,治療前,兩組血糖及血脂指標(biāo)相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后,對照組與試驗(yàn)組PG、2 h PG、HbAlc、INS、INS120′與治療前比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且試驗(yàn)組療效不低于對照組,兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。治療后,兩組TC、TG、LDL-C較治療前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且試驗(yàn)組不低于對照組,兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者HDL-C與治療前比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 兩組患者血糖相關(guān)指標(biāo)

表3 兩組患者血脂相關(guān)指標(biāo)

2.3 治療前后炎癥因子水平變化

本研究結(jié)果顯示,治療前,兩組血清炎癥因子水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后,兩組炎癥因子TNF-α、IL-6、hs-CRP水平與治療前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且試驗(yàn)組不低于對照組,兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 兩組患者炎癥因子

2.4 治療前后中醫(yī)癥狀積分

本研究結(jié)果顯示,治療前,兩組各中醫(yī)癥狀積分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后,對照組咽干口燥、多食易饑、口渴喜飲癥狀積分與治療前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),倦怠乏力、五心煩熱、大便干燥癥狀積分與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而試驗(yàn)組各個(gè)中醫(yī)癥狀積分較治療前比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且試驗(yàn)組優(yōu)于對照組(P<0.05)。見表5。

表 5 兩組患者中醫(yī)癥狀積分

2.5 2型糖尿病氣陰兩虛證與健康人的差異代謝物鑒定

通過OPLS-DA(正交偏最小二乘法)方法,根據(jù)VIP>1、 student’st檢驗(yàn)P<0.05篩選出區(qū)分2型糖尿病氣陰兩虛證與健康人的差異性代謝物,可作為潛在生物標(biāo)志物。顯著差異代謝物所參與的代謝途徑主要涉及脂類代謝和氨基酸代謝。見表6。

表6 2型糖尿病氣陰兩虛證與健康人的差異代謝物

2.6 差異代謝物含量

本研究對試驗(yàn)組治療前后、健康人對照組3組的血清差異代謝物進(jìn)行檢測,并繪制主成分分析圖(PCA圖)。見圖1。B1代表試驗(yàn)組治療前,B2代表試驗(yàn)組治療后,C代表健康對照組。從圖中可以看到,B1、B2、C組聚類明顯,且差異顯著;B1組與健康對照C組間差異最大,B2組向C組接近,說明經(jīng)過治療后,代謝產(chǎn)物的變化逐漸趨近于健康人的水平。

B1.試驗(yàn)組治療前; B2.試驗(yàn)組治療后;C.健康對照組。

3 討 論

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新興的一門系統(tǒng)生物學(xué),是了解生物體代謝產(chǎn)物功能作用的關(guān)鍵技術(shù)之一[6]。代謝組學(xué)提供了潛在代謝途徑的信息,可以進(jìn)一步確定糖尿病及其進(jìn)展機(jī)制。應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)方法研究糖尿病,可以提供一個(gè)全面的代謝網(wǎng)絡(luò),加深對分子的認(rèn)識,幫助發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn),還可對T2DM藥物療效進(jìn)行預(yù)測[7]。本研究以2型糖尿病患者為研究對象,運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)檢測其治療前后代謝產(chǎn)物的變化,發(fā)現(xiàn)其潛在生物標(biāo)志物主要有溶血磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、二酰甘油、三酰甘油、溶血磷脂、磷脂酰肌醇磷酸、膽甾烯基癸酸酯、二氫生物蝶呤、脲基琥珀酸,主要涉及脂肪酸代謝和氨基酸代謝途徑。有研究[8]報(bào)道,T2DM患者血液中的游離脂肪酸水平往往處于較高水平,脂質(zhì)代謝的紊亂會導(dǎo)致糖尿病病情進(jìn)展,人體肌肉中脂肪酸增加會引發(fā)丙酮酸脫氫酶失活,從而導(dǎo)致人體細(xì)胞內(nèi)血糖濃度升高。本研究對試驗(yàn)組治療前后、健康人對照組的血清差異代謝物進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)益氣甘露方治療后,2型糖尿病患者差異代謝產(chǎn)物含量水平逐漸趨近于健康人的水平。

本研究顯示:益氣甘露方治療氣陰兩虛型2型糖尿病總有效率高達(dá)92.50%,FPG、2 h PG、HbAlc、INS、INS120′、TC、TG、LDL-C水平與治療前比較均顯著下降(P<0.05),且療效不低于二甲雙胍對照組。經(jīng)益氣甘露方治療后,IL-6、TNF-α、hs-CRP炎癥因子水平較治療前均下降明顯。此外,益氣甘露方試驗(yàn)組的中醫(yī)癥狀積分經(jīng)治療后顯著下降(P<0.05),且優(yōu)于對照組。說明益氣甘露方可以有效降低2型糖尿病患者的血糖,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,減輕全身的炎癥反應(yīng)。益氣甘露方由玉液湯加減化裁而成,在玉液湯的基礎(chǔ)上,去知母、五味子,增加山萸肉、烏梅、麥冬、炙甘草,與玉液湯原方比較,其養(yǎng)陰生津功效增強(qiáng)。方中重用黃芪益氣生津?yàn)榫?西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰,天花粉能夠清肺胃熱,生津止渴;山藥、山萸肉補(bǔ)脾固腎,四者共為臣藥;葛根生津而止渴;翻白草、烏梅、麥冬清熱潤燥、生津止渴;雞內(nèi)金助脾之健運(yùn),運(yùn)化水谷精微,共為佐藥;炙甘草調(diào)和諸藥,為使藥,共奏益氣養(yǎng)陰、清熱生津之功。

益氣甘露方中很多中藥成分具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島素抵抗的治療作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[9-19]發(fā)現(xiàn),黃芪、葛根可以通過調(diào)控AMPK信號通路發(fā)揮糖脂平衡作用,且兩藥配伍的作用優(yōu)于單藥。西洋參富含皂苷成分,可以降低高血脂大鼠的甘油三酯和膽固醇水平。天花粉分離的酸性蛋白天花粉凝集素、山藥的多糖成分對實(shí)驗(yàn)動物的糖脂代謝、糖耐量異常具有改善作用。山茱萸提取物可以通過抑制炎癥因子、下調(diào)Akt磷酸化發(fā)揮抗炎作用,其活性成分馬錢苷、莫諾苷,對糖脂代謝、氧化應(yīng)激起積極的調(diào)控作用。翻白草中的黃酮、三萜類成分,烏梅提取物、麥冬和炙甘草的有效成分均具有血糖調(diào)節(jié)和抗氧化、抗炎活性。益氣甘露方以多成分、多靶點(diǎn)對糖脂平衡進(jìn)行協(xié)同調(diào)節(jié),具有改善糖尿病臨床癥狀的作用。

綜上所述,益氣甘露方可以有效調(diào)節(jié)2型糖尿病患者的血糖、血脂水平,改善臨床癥狀,降低炎癥反應(yīng),其主要參與脂肪酸代謝、氨基酸代謝等重要途徑,能夠提高患者的生活質(zhì)量。