劉玉瑩 熊志琦 蘇曉霞 王田田 吳闊 鄭寬瑜 張仲凱

摘要

病毒病對(duì)番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，近年來在番茄種植新區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，疑似為種子帶毒傳播。本研究通過對(duì)云南省怒江州番茄種植新區(qū)的番茄病毒病樣品采用RNAseq高通量測(cè)序，RTPCR驗(yàn)證的方法檢測(cè)病毒種類;對(duì)番茄病果種子進(jìn)行超薄切片制樣透射電子顯微鏡觀察，將病果種子播種后對(duì)種苗進(jìn)行RTPCR帶毒檢測(cè)。結(jié)果表明，RNAseq高通量測(cè)序及RTPCR檢測(cè)到的病毒有番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（tomato?zonate?spot?orthotospovirus，TZSV）、番茄黃斑駁相關(guān)病毒（tomato?yellow?mottleassociated?virus，TYMaV）、辣椒脈斑駁病毒（chili?veinal?mottle?virus，ChiVMV）、南方番茄病毒（southern?tomato?virus，STV）。透射電鏡觀察到種胚細(xì)胞及胚乳細(xì)胞中分布典型的正番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus病毒粒體。病果種子播種28?d后的種苗具有病毒病癥狀，通過RTPCR檢出TZSV、ChiVMV、STV，檢出率分別為60%、100%、80%。上述研究結(jié)果為TZSV通過種子傳播提供了有利的證據(jù)，并為源頭防控番茄病毒病提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞

番茄;?番茄病毒;?病毒檢測(cè);?RNAseq;?種傳病毒

中圖分類號(hào)：

S?436.412

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022753

Detection?and?seed?transmission?characteristics?of?tomato?viruses?in?tomato?planting?new?area?of?Nujiang，?Yunnan

LIU?Yuying1，2，?XIONG?Zhiqi1，2，?SU?Xiaoxia1，?WANG?Tiantian1，?WU?Kuo1，ZHENG?Kuanyu1*，?ZHANG?Zhongkai1*

（1.?Biotechnology?and?Genetic?Germplasm?Resources?Research?Institute，?Yunnan?Academy?of?Agricultural?Sciences，?

Yunnan?Provincial?Key?Lab?of?Agricultural?Biotechnology，?Kunming?650205，?China;?2.?School?of?Agriculture，?

Yunnan?University，?Kunming?650504，?China）

Abstract

Virus?diseases?have?caused?serious?harm?to?tomato?production.?In?recent?years，?it?has?occurred?seriously?in?some?new?tomato?planting?area，?and?the?source?of the?viruses?were?suspected?from?the?tomato?seeds.?In?this?study，?RNAseq?highthroughput?sequencing?and?RTPCR?were?used?to?detect?virus?species?in?diseased?tomato?samples?in?the?new?tomato?planting?area?of?Nujiang?prefecture，?Yunnan?province.?Furthermore，?the?diseased?tomato?fruit?seeds?were?collected?for?ultrathin?section?preparation?and?electron?microscopy?observation.?After?seeding?of?diseased?tomato?fruit?seeds，?the?seedlings?were?detected?for?viruses?by?RTPCR.?The?results?showed?that?the?viruses?detected?by?RNAseq?and?RTPCR?include?tomato?zonate?spot?orthotospovirus?（TZSV），?tomato?yellow?mottleassociated?virus?（TYMaV），?chili?veinal?mottle?virus?（ChiVMV）?and?southern?tomato?virus?（STV）.?The?Orthotospovirus?virions?were?observed?in?the?embryo?cells?of?the?diseased?tomato?fruit?seeds?by?transmission?electron?microscopy?（TEM）.?28?days?after?the?diseased?fruit?seeds?were?sown，?the?viral?like?symptoms?were?observed?on?seedlings.?TZSV，?ChiVMV?and?STV?were?detected?on?seedling?by?RTPCR，?and?the?infection?rates?were?60%，?100%?and?80%，?respectively.?These?results?provide?strong?evidence?for?TZSV?transmission?by?seeds?and?provide?a?basis?for?source?prevention?and?control?of?tomato?virus?disease.

Key?words

tomato;?tomato?virus;?virus?detection;?RNAseq;?seedtransmitted?virus

番茄Solanum?lycopersicum?L.是全球蔬菜生產(chǎn)中的大宗作物，而我國則是全球番茄生產(chǎn)面積與產(chǎn)量最大的國家。病毒病是危害番茄生產(chǎn)的主要病害。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道至少有312種病毒及病毒類致病因子（類病毒、衛(wèi)星病毒和病毒衛(wèi)星分子等）與番茄相關(guān)［1］。已報(bào)道的侵染番茄的主要病毒為煙草花葉病毒屬Tobamovirus病毒［2］，馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus病毒［34］，正番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus病毒［56］，菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus病毒［7］，以及黃瓜花葉病毒（cucumber?mosaic?virus，CMV）［8］、南方番茄病毒（southern?tomato?virus，STV）［9］等。通過對(duì)我國19個(gè)地區(qū)采集的170份番茄樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有22種番茄病毒，其中STV、番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（tomato?zonate?spot?orthotospovirus，TZSV）、辣椒脈斑駁病毒（chili?veinal?mottle?virus，ChiVMV）等為主要的流行病毒［10］。

TZSV是Orthotospovirus屬病毒，首次發(fā)現(xiàn)于云南省，為目前云南番茄上的主要流行病毒［11］。感染TZSV的番茄果實(shí)表面均分布有同心圓狀的斑紋，葉片出現(xiàn)壞死斑等癥狀［12］。自然條件下TZSV由薊馬傳毒，但其同屬的番茄斑萎病毒（tomato?spot?wilt?orthotospovirus，TSWV）已被證實(shí)可以通過種子進(jìn)行傳播［13］。ChiVMV是Potyvirus屬病毒，我國首次發(fā)現(xiàn)于海南?。?4］，侵染寄主以馬鈴薯、番茄、辣椒為主，主要通過蚜蟲傳播［15］，目前未見ChiVMV通過種子傳播的報(bào)道，但一部分Potyvirus屬病毒，如大豆花葉病毒（soybean?mosaic?virus，SMV）、菜豆普通花葉病毒（bean?common?mosaic?virus，BCMV）等已經(jīng)被證實(shí)可以通過種子傳播［16］。STV是無鞭毛病毒屬Amalgavirus病毒［9］，侵染番茄導(dǎo)致花葉病和黃色發(fā)育障礙，我國于2012年首次在山東省發(fā)現(xiàn)［17］。STV目前明確為種傳病毒，尚未發(fā)現(xiàn)其他傳播途徑，也未明確其病毒粒體形態(tài)［18］。番茄黃斑駁相關(guān)病毒（tomato?yellow?mottleassociated?virus，TYMaV）是細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬Cytorhabdovirus病毒，首次發(fā)現(xiàn)于重慶，攜帶這種病毒的番茄葉片表現(xiàn)小葉葉片外翻、黃色斑點(diǎn)、皺縮和斑點(diǎn)等癥狀;在進(jìn)化上與從蚜蟲中分離的昆蟲病毒非常接近，可能由蚜蟲傳播［10］。

種子是病毒傳播的主要途徑之一［19］。帶病毒種子通過貿(mào)易、調(diào)運(yùn)等方式進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，并且作為田間的初侵染源，是導(dǎo)致病毒病發(fā)生流行、產(chǎn)生危害的重要原因［20］。近年來的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在無初侵染源和傳毒介體昆蟲分布的番茄種植新區(qū)，番茄病毒病發(fā)生危害普遍，疑似種子攜帶病毒傳播。本研究對(duì)高黎貢山相對(duì)隔離的怒江州瀘水市魯掌鎮(zhèn)的1個(gè)番茄種植新區(qū)發(fā)生的番茄病毒病進(jìn)行采樣檢測(cè)，應(yīng)用高通量測(cè)序方法檢測(cè)病毒種類，對(duì)發(fā)病果實(shí)的種子進(jìn)行超薄切片制樣，透射電子顯微鏡觀察明確種子是否攜帶病毒，采用病毒特異性引物對(duì)種子和苗進(jìn)行RTPCR檢測(cè)，確定帶病毒種子是否傳毒，為源頭防控番茄病毒病提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?樣品來源

2020年7月在怒江州瀘水市魯掌鎮(zhèn)的番茄種植新區(qū)進(jìn)行病毒病害調(diào)查。瀘水市魯掌鎮(zhèn)番茄種植新區(qū)四面環(huán)山，為相對(duì)隔離的種植環(huán)境（圖1a），調(diào)查該種植區(qū)內(nèi)番茄病害情況，發(fā)現(xiàn)番茄果實(shí)主要表現(xiàn)2種癥狀，一種為成熟果實(shí)上具黃色斑點(diǎn)及環(huán)斑（圖1b），樣品編號(hào)為20YV048;另一種為未成熟果實(shí)上褐色壞死斑（圖1c），樣品編號(hào)為20YV049。

1.2?方法

1.2.1?RNAseq高通量測(cè)序分析

分別對(duì)樣品20YV048及20YV049進(jìn)行RNAseq高通量測(cè)序。使用TRIzol?（Thermo?Fisher?Scientific，?Madison，?WI，?USA）提取病果番茄總RNA，并用RiboZero?Plant?（Illumina，?San?Diego，?CA，?USA）去除核糖體RNA后，使用HiFiScriptgDNA?Removal?RT?MasterMix（康為世紀(jì)，北京，中國）試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行建庫測(cè)序?（IlluminaHiSeq?X?ten），單

圖1?怒江州瀘水市魯掌鎮(zhèn)番茄種植新區(qū)生境及番茄癥狀

Fig.1?Habitat?of?new?tomato?planting?area?in?Luzhang?town，?Lushui?city，?Nujiang?prefecture?and?tomato?symptoms

條reads讀長150?bp，每個(gè)樣品測(cè)序3?G的原始數(shù)據(jù)量。使用Trinity?軟件（trinityrnaseq_r20131110）進(jìn)

行序列拼接，并在NCBI上進(jìn)行BLASTN及BLASTX比對(duì)注釋。以拼接注釋到的病毒全序列為模板，進(jìn)一步在clean?reads數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)各病毒比對(duì)到的reads數(shù)，進(jìn)一步根據(jù)各病毒reads數(shù)計(jì)算Transcripts?Per?Kilobase?Million?（TPM），即各病毒在樣本中的相對(duì)占比。使用NCBI?BLAST進(jìn)行序列相似性分析，使用MEGA?6.0軟件，鄰接法1?000次重復(fù)比對(duì)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.2?超薄切片制樣透射電子顯微鏡觀察

將番茄病果樣品種子取出，去除種皮，對(duì)種胚按照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行超薄制樣［21］，應(yīng)用FEI透射電子顯微鏡（Tecnai?G2?Spirit?TWIN）對(duì)樣品進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.3?番茄病果種子采集與播種

采集番茄病果種子，用20%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒5?min后［22］，單粒分別放入墊有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，加入無菌蒸餾水，保持培養(yǎng)皿的濕潤，光照培養(yǎng)箱28℃進(jìn)行催芽，待番茄種子發(fā)芽后，移栽到滅菌的土壤中進(jìn)行種植，待長出4片真葉后取葉片進(jìn)行病毒檢測(cè)。

1.2.4?RTPCR檢測(cè)

使用RNA快速提取試劑盒（寶生物，日本）對(duì)番茄種苗的總RNA進(jìn)行提取，通過一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)，中國）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)RNAseq測(cè)序結(jié)果，分別針對(duì)TYMaV、TZSV、ChiVMV、STV序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1）進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。RTPCR反應(yīng)體系為20?μL：2×Taq?Master?Mix?10?μL，cDNA模板3?μL，RNaseFree水6?μL，上游引物?0.5?μL，下游引物?0.5?μL。98℃預(yù)變性10?s;98℃變性10?s，55℃退火30?s，72℃延伸30?s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸5?min。

2?結(jié)果與分析

2.1?怒江州番茄種植新區(qū)番茄病毒病樣品的病毒種類

RNAseq高通量測(cè)序得到20YV048?raw?reads為23.89?M，去除冗余序列和低質(zhì)量序列后得到的clean?reads為23.48?M，Q30為94.53%;20YV049?raw?reads為25.11?M，去除冗余序列和低質(zhì)量序列后得到的clean?reads為24.61?M，Q30為94.14%。對(duì)得到的clean?reads使用Trinity軟件進(jìn)行拼接，拼接后的序列經(jīng)注釋后，在2個(gè)樣本20YV048及20YV049中均發(fā)現(xiàn)有4種植物病毒，包括TZSV、TYMaV、STV、ChiVMV。進(jìn)一步采用RTPCR對(duì)兩個(gè)樣本20YV048及20YV049進(jìn)行病毒檢測(cè)及測(cè)序，結(jié)果在2個(gè)樣本中均檢測(cè)到以上4個(gè)病毒。以上4個(gè)病毒全基因組序列為模板，對(duì)clean?reads數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)各病毒的reads數(shù)，以TPM值計(jì)算各病毒reads數(shù)在樣本中的相對(duì)豐度占比，發(fā)現(xiàn)TZSV在20YV048中豐度占比為94.77%，在20YV049中豐度占比為99.01%，在2個(gè)樣本中均為優(yōu)勢(shì)病毒。比較2個(gè)樣本中TZSV_S、TZSV_M及TZSV_L片段的相對(duì)豐度占比，發(fā)現(xiàn)20YV048中TZSV_S片段相對(duì)豐度占比（61.96%）高于20YV049（52.95%），而20YV049中TZSV_M及TZSV_L片段相對(duì)豐度占比（33.68%，12.38%）高于20YV048（24.05%，8.76%）（表2）。

2.2?怒江州番茄種植新區(qū)番茄病毒病樣品的病毒序列分析

根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果，TZSV怒江分離物N基因序列與云南煙草分離物11YV229（JN116581）N基因序列具有最高相似性，達(dá)97.37%;根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，與TZSV云南鬼針草分離物MG656993聚在同一分支（圖2a）。ChiVMV怒江分離物與四川分離株?Yp8（KC711055.1）具有最高相似性（97.28%）;根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，ChiVMV怒江分離物與四川分離物KC711056，MK405594，?KC711055聚在同一分支，親緣關(guān)系最近，而與云南煙草分離物JX088636親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖2b）。STV怒江分離物與泰國分離物L(fēng)C487710.1相似性最高，達(dá)99.91%;根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，STV怒江分離物與泰國分離物L(fēng)C487710.1、孟加拉分離物KT634055.1、英國分離物KY810783.1、塞爾維亞分離物MT269808.1聚在同一分支（圖2c）。TYMaV怒江分離物與目前報(bào)道的TYMaV分離物相似性在85.1%～85.6%，其中與浙江分離物OP296980.1具有最高相似性，達(dá)85.6%，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，與廣東分離物MW527091.1親緣關(guān)系最近，聚在同一分支，相似性為85.4%（圖2d）。

2.3?番茄病果種胚及胚乳中病毒粒體的電子顯微鏡觀察

通過FEI透射電子顯微鏡80?kV加速電壓觀察，在20YV048及20YV049樣品果實(shí)種子的種胚細(xì)胞及胚乳細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)具囊泡包裹的球狀病毒粒體，直徑約80～120?nm，為典型的正番茄斑萎病毒屬病毒粒體的形態(tài)特征［6，21］，病毒粒體呈單顆粒，外有單層膜包裹，分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖3）。

2.4?番茄病果種子播種種苗的RTPCR檢測(cè)

進(jìn)一步將收集的20YV048病果種子播種，約28?d后，發(fā)現(xiàn)其種苗葉脈壞死，葉片出現(xiàn)黃斑、黃化及壞死斑等（圖4）典型病毒病癥狀。選取10株種苗分別進(jìn)行TZSV、TYMaV、ChiVMV、STV病毒的RTPCR檢測(cè)（表3），檢測(cè)結(jié)果顯示，病果種子發(fā)育的種苗上檢測(cè)到TZSV、ChiVMV及STV?3種病毒，TZSV的檢出率為60%，ChiVMV檢出率為100%，STV的檢出率為80%，TYMaV檢出率為0%。

3?結(jié)論與討論

種傳病毒分為兩種：一種是胚外感染，即病毒粒體存在于種皮或表面，或者胚乳中，未進(jìn)入種胚;另一種是胚內(nèi)感染，即病毒粒體進(jìn)入種胚［23］。煙草花葉病毒屬病毒，如煙草花葉病毒（tobacco?mosaic?virus，TMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber?green?mottle?mosaic?virus，CGMMV）、褐色皺紋果病毒（tomato?brown?rugose?fruit?virus，ToBRFV）、番茄花葉病毒（tomato?mosaic?virus，ToMV）等主要以胚外感染為主［2425］。此類病毒可長期穩(wěn)定地存在于種皮（或種皮表面），即使在種子收獲和脫水后病毒也能長期保持侵染活性，受病毒污染的種子發(fā)芽后則通過摩擦接觸或機(jī)械傳播等方式二次傳播侵染幼苗［24］。Potyvirus屬病毒中SMV、BCMV、豌豆種傳花葉病毒（pea?seedborne?mosaic?virus，PSbMV）等為胚內(nèi)感染的病毒［16］，病毒粒體可侵染種胚，其侵染途徑可發(fā)生在種胚發(fā)育前，由胚珠、大孢子母細(xì)胞或花粉母細(xì)胞攜帶病毒發(fā)生侵染，或在種胚發(fā)育過程中由病毒直接侵染［16］。Orthotospovirus屬病毒目前報(bào)道的可種傳病毒有2個(gè)，一個(gè)為大豆脈壞死病毒（soybean?vein?necrosis?virus，SVNV）［26］，一個(gè)為TSWV，其中TSWV被證實(shí)能侵染種胚，但同時(shí)研究顯示胚乳帶毒率要顯著高于種胚帶毒率［13］。TZSV與TSWV為同屬病毒，本研究雖然在番茄種胚及胚乳中均發(fā)現(xiàn)番茄斑萎病毒屬病毒粒體，結(jié)合RNAseq及RTPCR檢測(cè)結(jié)果，初步證明TZSV可通過種子傳播，但TZSV主要通過種胚感染還是胚外感染進(jìn)行種傳仍需要進(jìn)一步研究。此外，在病果的子代種苗中檢測(cè)到ChiVMV和STV，說明ChiVMV和STV也可能為種傳病毒。但由于本研究中的試驗(yàn)材料為復(fù)合侵染樣品，樣品中TZSV為優(yōu)勢(shì)種病毒，ChiVMV和STV表達(dá)豐度較低，未能在種胚或胚乳中發(fā)現(xiàn)ChiVMV和STV病毒粒子，種傳證據(jù)還不夠充分。下一步應(yīng)通過單接種病毒及種子不同組織部位帶毒檢測(cè)、免疫標(biāo)記定位等手段進(jìn)一步明確ChiVMV和STV在種子中的分布特征及種傳特性。

種子攜帶病毒可以在親本與子代之間垂直傳播，也可以在作物與作物之間水平傳播［27］。種子帶毒是田間的重要初侵染源，可通過接觸摩擦、介體傳毒等方式進(jìn)一步形成二次侵染，引起病毒病的暴發(fā)流行，造成嚴(yán)重危害。因此，加強(qiáng)對(duì)種子帶病毒的檢測(cè)，降低種子帶病毒率可有效防止病毒病的發(fā)生。采用鹽酸浸種、干熱處理、溫湯浸種以及臭氧（10?g/m3）熏蒸處理可將種傳病毒的濃度降低，且對(duì)種子發(fā)芽不會(huì)產(chǎn)生任何影響［19］。對(duì)于進(jìn)入種子胚中的病毒，一般采用干熱處理鈍化種子胚中的病毒。

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（責(zé)任編輯：田?喆）