何鵬搏 何鵬飛 吳毅歆 陳倩 趙正龍 亢波 唐萍 譚萬(wàn)忠 何月秋 王云月

摘要

由寬頸附球孢菌Epicoccum?latusicollum?Qian?Chen，Crous?&?L.?Cai引起的玉米白斑病正在我國(guó)局部地區(qū)流行，導(dǎo)致重大損失，并有擴(kuò)大流行范圍的趨勢(shì)。為了增加植保及玉米抗病育種工作者對(duì)玉米白斑病的了解，本文描述了該病害的癥狀特點(diǎn)、病原菌特征，總結(jié)了發(fā)生規(guī)律、病害循環(huán)及分離鑒定和診斷技術(shù)。玉米白斑病菌能在病殘?bào)w上越冬，種子帶菌是其遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑，風(fēng)夾雨、昆蟲及農(nóng)事操作人員活動(dòng)是近距離傳播途徑。7月中下旬至9月中下旬是白斑病流行高峰期，病菌與玉米適宜生長(zhǎng)溫度基本一致，具有擴(kuò)散傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞

玉米白斑病;?寬頸附球孢菌;?病害癥狀;?發(fā)生規(guī)律;?診斷

中圖分類號(hào)：

S?435.131.49

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022727

Symptom?recognition?and?diagnosis?of?maize?white?spot

HE?Pengbo1，?HE?Pengfei1，?WU?Yixin1，?CHEN?Qian2，?ZHAO?Zhenglong1，?KANG?Bo1，MUNIR?Shahzai1，?TANG?Ping1，?TAN?Wanzhong1，?HE?Yueqiu1*，?WANG?Yunyue1*

（1.?Yunnan?Agricultural?University，?Kunming?650201，?China;?2.?State?Key?Laboratory?of?Mycology，?

Institute?of?Microbiology，?Chinese?Academy?of?Sciences，?Beijing?100101，China）

Abstract

Maize?white?spot?（MWS），?caused?by?Epicoccum?latusicollum?Qian?Chen，?Crous?&?L.?Cai，?is?endemic?in?local?areas?of?China，?resulting?in?significant?losses?and?exhibiting?a?tendency?to?expand?endemic?area.?In?order?to?deepen?understanding?of?MWS?among?plant?protection?workers，?maize?resistance?breeders?and?related?parties，?the?characteristics?of?symptoms?and?the?MWS?pathogen?were?described，?and?the?occurrence?regularity，?disease?cycle，?isolation?and?identification?of?the?pathogen?and?diagnosis?techniques?were?summarized?in?this?paper.?E.latusicollum?can?overwinter?on?the?diseased?bodies，?and?the?carriage?by?maize?seeds?is?the?main?way?of?its?longdistance?transmission，?wind?and?rain?splash，?insects?and?farm?operators?are?the?way?of?closedistance?transmission.?The?MWS?epidemic?peak?occurred?from?midlate?July?to?midlate?September，?and?the?optimum?growth?temperature?of?the?pathogen?was?basically?the?same?as?that?of?maize，?implying?that?the?disease?has?the?risk?of?spreading?nationwide.

Key?words

maize?white?spot;?Epicoccum?latusicollum;?disease?symptom;?occurrence?regularity;?diagnosis

玉米白斑?。╩aize?white?spot，?MWS）在我國(guó)于20世紀(jì)90年代在廣西、云南南部山區(qū)偶有所見(jiàn)，但近年來(lái)在我國(guó)西南玉米產(chǎn)區(qū)來(lái)勢(shì)洶洶，目前在云南、廣西、貴州、四川、湖北、重慶山區(qū)均有發(fā)生［1］，其中云南省最為嚴(yán)重，我們的調(diào)查結(jié)果表明，該病可導(dǎo)致玉米感病品種產(chǎn)量損失20%～40%。國(guó)外學(xué)者把與本病癥狀相似的玉米病害歸于玉米暗球腔菌Phaeosphaeria?maydis引起的葉斑?。≒haeosphaeria?leaf?spot，PLS），Casela等［2］與Flett等［3］報(bào)道PLS在巴西和南非已成為玉米重要病害之一。由于病菌對(duì)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分離中消毒劑較敏感，分離不易成功，致使不同研究者對(duì)病原菌的歸屬看法不一致［2，?45］。為了給植物保護(hù)工作者、玉米抗病育種者及其他人員提高對(duì)玉米白斑病的認(rèn)識(shí)和鑒定能力，本文依據(jù)我們的研究結(jié)果，就病害癥狀、病原菌、發(fā)生規(guī)律、病害循環(huán)、分離與鑒定技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的歸納總結(jié)。

1?玉米白斑病癥狀

玉米白斑病為葉部病害。在玉米葉片上首先出現(xiàn)針尖大小的暗綠色圓形病斑，后逐漸擴(kuò)大成白色圓形、長(zhǎng)圓形、長(zhǎng)形、不規(guī)則形，邊緣整齊，內(nèi)側(cè)有寬約1?mm褐色環(huán)形壞死線。葉片上病斑正反兩面大小和顏色完全一致，或者幾近一致。病斑因失水而出現(xiàn)突然下陷、干癟的癥狀。病斑變白、變干（圖1a、1c）。病斑初期單生，直徑為0.3～2.0?cm，后期常多個(gè)病斑愈合成不規(guī)則的大病斑，直徑3～5?cm。病斑增多時(shí)，整個(gè)葉片變白、枯草色，枯死（圖1b），少數(shù)病斑因中間脫落而出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象（圖1c）。中后期的病斑長(zhǎng)出褐色或黑褐色小顆粒（分生孢子器噴吐出膠質(zhì)狀的分生孢子堆），分生孢子器埋生于葉片表皮之下，在病斑中排列不規(guī)則（圖1cf）。但發(fā)病初期或者遇不適宜天氣條件時(shí)，病斑上無(wú)黑色小顆粒。

2?玉米白斑病的病原菌

玉米白斑病是由子囊菌門Ascomycota座囊菌綱Dothideomycetes格孢腔菌目Pleosporales亞隔孢殼科Didymellaceae寬頸附球孢菌Epicoccum?latusicollum?Qian?Chen，Crous?&?L.?Cai所引起。在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）上接種1個(gè)直徑5～6?mm菌絲塊，于28℃下暗培養(yǎng)7?d后，菌絲可布滿直徑9?cm的培養(yǎng)皿。菌絲初期為白色密絨毛狀，中后期分泌淺紅色色素，菌落邊緣整齊規(guī)則，菌落正面中央粉白至淺棕色，邊緣為白色，背面淡棕色或淺粉紅色，但因培養(yǎng)基不同，菌落的顏色有變化。分生孢子器球形，上端有孔口，但有時(shí)不明顯，埋生于病斑之下，遇雨水時(shí)，其內(nèi)噴出分生孢子，后期孢子溢出物變淺褐色、褐色、黑色。分生孢子器在PDA上易形成，半埋生或者表生。在培養(yǎng)3～5?d后，用滅菌的玻片輕刮菌落上的表生菌絲，24?h后，便可以看到分子孢子器上噴出大量膿樣的孢子溢出物。孢子溢出物淺泥土色。分生孢子器褐色、黑褐色，直徑90～110?μm。分生孢器在顯微鏡下，遇水噴出柱狀、蛇曲狀的分生孢子束。單個(gè)分生孢子透明、薄壁且光滑，呈卵圓形至長(zhǎng)卵形，無(wú)隔，單胞，大小為：（5.4～6.5）?μm×（2.5～3.5）?μm［1］（圖2）。

圖2?玉米白斑病菌形態(tài)

Fig.2?Morphology?of?the?pathogen?of?maize?white?spot，?Epicoccum?latusicollum

玉米白斑病菌菌絲在5～35℃下均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為?28～30℃;pH?3.0～10.0范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，最適pH為7.0?左右。分生孢子在13～44℃溫度范圍內(nèi)均能萌發(fā)，最適宜萌發(fā)的溫度在25～30℃，最適宜萌發(fā)濕度在90%以上。它在玉米汁蔗糖培養(yǎng)基（玉米200?g，煮沸20?min后過(guò)濾，取濾液加瓊脂粉15?g、蔗糖15?g，加水定容至1?000?mL;MSA）上生長(zhǎng)速度最快，在PDA、燕麥瓊脂培養(yǎng)基?（OA）上生長(zhǎng)速度居中，在玉米汁培養(yǎng)基（玉米200?g，高壓煮沸20?min后過(guò)濾，取濾液加瓊脂粉15?g，加水定容至1?000?mL;MA）上生長(zhǎng)較慢［1］。

3?玉米白斑病發(fā)生規(guī)律

玉米白斑病發(fā)生規(guī)律還不完全清楚。從作者近3年調(diào)查的結(jié)果來(lái)看，玉米品種對(duì)白斑病的抗病性差別大，從近乎免疫到高度感病。中抗以上的品種約占50%。田間主要在大喇叭口期后開(kāi)始出現(xiàn)病斑，越往后，病情越重。在乳熟期，高感品種的葉片慢慢枯死，至成熟期，葉片全部枯死。山區(qū)病害比平原嚴(yán)重，田間肥料多少與病害嚴(yán)重度關(guān)系不密切。在周年種植玉米的區(qū)域，病菌沒(méi)有越冬期，可以周而復(fù)始地輾轉(zhuǎn)傳播，引起發(fā)病。但一年內(nèi)病情發(fā)生最為嚴(yán)重時(shí)間在7月中旬至9月中下旬。

4?病害循環(huán)

玉米白斑病菌可以分生孢子器和菌絲體在玉米病葉片、苞葉上越冬，亦可隨著這些病殘?bào)w在土壤表面越冬，病菌可以分生孢子或者分生孢子器粘附到種子表面越冬和遠(yuǎn)距離傳播。在田間適合發(fā)病的條件下，風(fēng)夾雨是傳播的主要途徑，爬行的昆蟲及田間農(nóng)事操作者也可近距離傳播。

5?分離鑒定技術(shù)

5.1?分離技術(shù)

5.1.1?組織分離法

用常規(guī)組織分離法從發(fā)病植株葉片的典型病斑上分離白斑病病原物。將新鮮病葉沖洗干凈，取病健交界處大小5?mm×5?mm的組織，用75%乙醇消毒5?s，2.5%次氯酸鈉浸泡2?min，無(wú)菌水漂洗3次，置于無(wú)菌吸水紙上吸干水分后轉(zhuǎn)移至含有10?μg/mL氯霉素的PDA平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，待病葉組織邊緣長(zhǎng)出菌絲后，挑取菌絲尖端，轉(zhuǎn)入新的PDA平板進(jìn)一步純化培養(yǎng)。

5.1.2?涂板分離法

鑒于白斑病菌對(duì)常用的乙醇、升汞和漂白粉很敏感，不易分離成功的特點(diǎn)，病菌的分離可以采用涂板法。病組織按上述方法表面消毒后，放入滅菌的研缽中，加入少量滅菌水，用碾槌碾磨至糊狀體，再加入適量的滅菌水充分稀釋，取稀釋液涂布于加有10?μg/mL氯霉素的PDA平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出圓形小菌落后，挑取菌絲灰白色，背面有淺棕色或淺粉紅色、淡褐色雜糅的菌落邊緣轉(zhuǎn)入新的PDA平板進(jìn)一步純化培養(yǎng)。注意務(wù)必挑取類型占比多的菌落，如果挑取比例較少的菌落，可能分離不易成功。

5.2?鑒定技術(shù)

5.2.1?顯微切片法

玉米白斑病發(fā)生早期或者天氣原因，時(shí)常只是看到白色病斑癥狀，無(wú)菌絲、無(wú)子實(shí)體等病征，有時(shí)直接刮取病組織表面，在顯微鏡下也看不到真正的病菌，而時(shí)常會(huì)看到少量鐮刀菌Fusarium?spp.、鏈格孢Alternaria?spp.等腐生性強(qiáng)的真菌。遇到這種情況時(shí)，采用常規(guī)組織切片法是可行的。即切好病組織薄片后，直接在顯微鏡下檢查，看是否有分生孢子器埋生于病組織中，如果見(jiàn)到了典型分生孢子器，那就可能獲得了一個(gè)初步證據(jù)，該病可能由寬頸附球孢菌引起。

5.2.2?形態(tài)學(xué)鑒定法

1）觀察菌落形態(tài)、顏色;2）觀察菌落中的分生孢子器和分生孢子形態(tài)，測(cè)量它們的大小。如果符合前述形態(tài)特征，就可以進(jìn)一步確認(rèn)所分離到的病菌可能為寬頸附球孢菌。

5.2.3?分子鑒定法

如有需要，則按文獻(xiàn)［1，6］方法進(jìn)行。采用CTAB法［7］提取可能菌株的基因組DNA。分別用ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGC3′）/ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′），Btub2Fd（5′GTBCACCTYCARACCGGYCARTG3′）/Btub4Rd

（5′CCRGAYTGRCCRAARACRAAGTTGTC3′），

RPB25F2（5′GGGGWGAYCAGAAGAAGGC3′）/

fRPB27cR（5′CCCATRGCTTGYTTRCCCAT3′），

LR0R（5′AGATGAAAAGAACTTTGAAAAGA

GAG3′）/LR7（5′TACTACCACCAAGATCT3′）引物對(duì)ITS、tub2、rpb2和LSU基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（20?μL）：5?U/μL?Taq?DNA?polymerase?0.2?μL，10×Taq?Buffer?2.0?μL，0.2?mmol/L?dNTPs?1.6?μL，DNA?1.0?μL，10?μmol/L上下游引物各1.0?μL，用超純水補(bǔ)足體積至20.0?μL。ITS擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5?min;95℃變性30?s，48℃退火30?s，72℃延伸80?s，35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10?min。tub2擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5?min;95℃變性30?s，52℃退火30?s，72℃延伸80?s，35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10?min。rpb2擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5?min;94℃變性45?s，60℃退火45?s，72℃延伸2?min，5個(gè)循環(huán);94℃變性45?s，58℃退火45?s，72℃延伸2?min，5個(gè)循環(huán);94℃變性45?s，54℃退火45?s，72℃延伸2?min，30個(gè)循環(huán);72℃再延伸8?min。LSU擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5?min;95℃變性45?s，48℃退火45?s，72℃延伸2?min，35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10?min。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，從GenBank網(wǎng)站下載其他近似菌株及WS1?（OM131567）和WS191?（OM131595）序列和外組菌株對(duì)應(yīng)序列，使用MEGAX軟件剪切各序列，使相同基因片段序列的長(zhǎng)度一致，按照rpb2tub2ITSLSU的順序首尾拼接，分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用鄰接法進(jìn)行聚類分析，自展值設(shè)為1?000，確定種的分類地位。當(dāng)新分析的未知菌株與已知菌株序列同源性達(dá)99%以上，與已知菌株WS1和WS191聚為一支時(shí)，且切片法所用的葉片癥狀與白斑病基本一致，病菌形態(tài)學(xué)與Epicoccum?latusicollum基本一致，所分離的病害屬于玉米白斑病。

參考文獻(xiàn)

［1］?張珊，?朱自萍，?何鵬搏，等.?云南省玉米白斑病的病菌鑒定與品種田間抗病性調(diào)查分析［J］.?植物保護(hù)學(xué)報(bào)，?2022，?49（3）：?840847.

［2］?CASELA?C?R.?The?Phaeosphaeria?leaf?spot?［M］∥?CASELA?C?R，?RENFRO?R，?KRATTIGER?A?F.?Diagnosing?maize?diseases?in?Latin?America.?Isaa/Embrapa，?Ithaca，?NY，?USA?and?Brasilia，?BR，?Brazil，?1998：157.

［3］?FLETT?B?C，?BENSCH?M?J，?SMIT?E，?et?al.?A?;field?guide?for?identification?of?maize?diseases?in?south?Africa?［Z］.?ARCLNR，?Potchefstroom，?South?Africa，?1996.

［4］?CARSON?M?L，?GOODMAN?M?M，?GLAWE?D?A.?Phaeosphaeria?leaf?spot?of?maize?in?Florida?［J］.?Plant?Disease，?1991，?75：?968.?

［5］?CARSON?M?L.?Vulnerability?of?U.S.?maize?germ?plasm?to?Phaeosphaeria?leaf?spot?［J］.?Plant?Disease，?1999，?83（5）：?462464.

［6］?陳倩.?亞隔孢殼科的系統(tǒng)演化及分類學(xué)研究［D］.?北京：?中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，?2015.

［7］?HE?Yueqiu.?An?improved?protocol?for?fungal?DNA?preparation?［J］.?Mycosystema，?2000，?19（3）：?434.

（責(zé)任編輯：田?喆）