鐘靜 李婷婷 韓天華 李學衛(wèi) 尹躍艷 陳越 馬文廣 丁銘

摘要

番茄斑萎病毒（tomato?spotted?wilt?virus，?TSWV）和煙草花葉病毒（tobacco?mosaic?virus，?TMV）是2種重要的植物病原病毒，對多種經(jīng)濟作物的產量和品質均造成嚴重影響。2021年-2022年，在云南省麗江市煙草種植區(qū)不同煙區(qū)采集葉片黃化、皺縮以及無癥狀的青蒿Artemisia?caruifolia樣品共計14份，利用免疫金標速測卡和RTPCR對其病原病毒進行檢測。利用免疫金標速測卡檢測結果顯示，在所檢樣品中有9份樣品檢測出TSWV，檢出率為64.28%，有3份樣品檢測出TMV，檢出率為21.43%，2種病毒復合侵染的檢出率同樣為21.43%;利用RTPCR對復合侵染的3份樣品進行分子檢測，結果顯示，在3份復合侵染青蒿樣品中獲得3條TSWV?N基因序列、3條TMV?cp基因序列和2條TMV?RdRp部分序列。TSWV青蒿分離物與分離自云南的TSWV2分離物相似性最高，為99.6%;TMV青蒿分離物與分離自遼寧的TMVShenyang分離物和分離自云南的TMVYongren1相似性最高，均大于99.4%。這是首次發(fā)現(xiàn)TSWV和TMV?2種不同屬病毒復合侵染青蒿。

關鍵詞

番茄斑萎病毒;?煙草花葉病毒;?青蒿;?復合侵染

中圖分類號：

S?435.72

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022728

Molecular?identification?and?sequence?analysis?of?tomato?spotted?wilt?virus?and?tobacco?mosaic?virus?on?Artemisia?caruifolia

ZHONG?Jing1#，?LI?Tingting1#，?HAN?Tianhua2，?LI?Xuewei2，?YIN?Yueyan3，?CHEN?Yue1，

MA?Wenguang2*，?DING?Ming1*

（1.?Institute?of?Biotechnology?and?Germplasm?Resources，?Yunnan?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Yunnan?Provincial?

Key?Laboratory?of?Agricultural?Biotechnology，?Key?Laboratory?of?the?Southwestern?Crop?Gene?Resources?and?

Germplasm?Innovation，?Ministry?of Agriculture?and?Rural?Affairs，?Kunming?650223，?China;?2.?Lijiang?Branch?

Company?of?Yunnan?Tobacco?Company，?Lijiang?674100，?China;?3.?Institute?of?Alpine?Economic?Plant，?Yunnan?

Academy?of?Agricultural?Sciences，?Lijiang?674199，?China）

Abstract

Tomato?spotted?wilt?virus?（TSWV）?and?tobacco?mosaic?virus?（TMV）?are?two?important?viral?pathogens?that?account?for?significant?yield?losses?and?quality?damage?in?many?economically?important?crops.?During?2021-2022，?14?sweet?wormwood?（Artemisia?caruifolia）?leaf?samples?with?leaf?yellowing?and?curling?symptoms?or?asymptomatic?were?collected?from?tobacco?fields?in?Lijiang?of?Yunnan?province.?The?colloidal?gold?antigen?rapid?screen?kits?and?RTPCR?were?used?to?identify?the?pathogens?of?diseased?plants.?Immunological?assays?using?colloidal?gold?antigen?rapid?screen?kits?showed?that?nine?leaf?samples?were?infected?with?TSWV?（64.28%?positive?rate），?three?infected?with?TMV?（21.43%?positive?rate），?and?three?infected?with?both?TSWV?and?TMV.?RTPCR?was?carried?out?to?obtain?viral?sequences?from?these?three?coinfected?sweet?wormwood?samples.?Then?three?N?gene?sequences?of?TSWV，?three?cp?sequences?and?two?partial?RdRp?sequences?of?TMV?were?obtained.?Sequence?alignment?showed?that?the?TSWV?isolates?were?most?closely?related?to?the?TSWV2?isolate?from?Yunnan?sharing?99.6%?sequence?identity，?and?the?TMV?isolates?shared?the?highest?sequence?identity?（>99.4%）?with?the?Shenyang?isolate?from?Liaoning?and?Yongren1?isolate?from?Yunnan.?It?is?the?first?report?that?sweet?wormwood?plants?were?coinfected?by?TSWV?and?TMV.

Key?words

tomato?spotted?wilt?virus;?tobacco?mosaic?virus;?Artemisia?caruifolia;?mixed?infection

番茄斑萎病毒（tomato?spotted?wilt?virus，?TSWV）屬于布尼亞病毒目Bunyavirales番茄斑萎病毒科Tospoviridae正番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus，病毒粒子為球狀，大小為80～120?nm［1］。TSWV基因組包含L?RNA（9.8?kb）、M?RNA（4.8?kb）和S?RNA（2.9?kb）3條鏈，共編碼5個蛋白。L鏈編碼331.5?kD的RNA聚合酶蛋白（RNA?polymerase），M鏈編碼33.6?kD的非結構蛋白NSm和127.4?kD的糖蛋白GnGc，S鏈編碼52.4?kD的非結構蛋白NSs和28.8?kD的核殼體蛋白（uncleocapsid?protein，?N），其中核殼體蛋白N為TSWV分類的重要依據(jù)［2］。TSWV侵染后植株表現(xiàn)出枯萎、環(huán)斑以及頂梢枯死等癥狀。目前至少有9種薊馬能夠傳播番茄斑萎病毒，其中西花薊馬Frankliniella?occidentalis是最重要的一種，傳播方式為持久性循回增殖傳播，由于TSWV可以在薊馬體內復制增殖，所以薊馬不僅是番茄斑萎病毒的傳播介體，還是番茄斑萎病毒的天然宿主［3］。自1915年在澳大利亞發(fā)現(xiàn)至今，TSWV已在中國、伊朗、土耳其、意大利、美國、孟加拉、韓國等幾十個國家和地區(qū)發(fā)生，在世界范圍內對各地農作物造成嚴重危害，從而造成嚴重的經(jīng)濟損失［46］。在我國，TSWV也對不同地區(qū)的作物造成了嚴重危害，且分布范圍廣，從北京、山東到寧夏再到云南均有TSWV發(fā)生;而在云南省辣椒Capsicum?annuum、萵苣Lactuca?sativa、生菜L.sativa?var.?romosa、番茄Solanum?lycopersicum等作物均不同程度地受到TSWV危害［712］。

煙草花葉病毒（tobacco?mosaic?virus，?TMV）屬于馬泰利病毒目Martellivirales植物桿狀病毒科Virgaviridae煙草花葉病毒屬Tobamovirus，病毒粒子為桿狀，大小為18?nm×300?nm。TMV為正義單鏈RNA病毒，基因組全長為6?395?bp，有3個開放閱讀框，至少編碼4個蛋白，分別為126?kD和?183?kD?的復制蛋白（replication?protein，?Rep）、30?kD?的運動蛋白（movement?protein，?MP）以及17.5?kD的外殼蛋白（coat?protein，?CP），其中外殼蛋白是TMV分類的重要依據(jù)［2］。在自然界中TMV主要通過汁液摩擦傳播，同時也通過蚜蟲、土壤以及種子傳播，不同寄主被侵染后表現(xiàn)出不同的癥狀，侵染煙草時表現(xiàn)出黃綠相間的花葉癥狀，嚴重時形成皰斑。TMV的分布范圍十分廣泛，在巴西、韓國、美國、中國、德國等國家均有發(fā)生［1315］。2011年TMV被列為世界十大植物病毒之首［16］。

青蒿Artemisia?caruifolia為菊科Compositae蒿屬Artemisia一年生草本植物，具有清熱、涼血以及解暑等藥用價值［17］，在我國各地均有分布，是田間重要雜草，同時也是多種植物病原病毒的重要中間寄主。麗江市金沙江流域煙草產區(qū)是云南省特色煙草產區(qū)，本研究利用免疫金標速測卡和RTPCR?2種檢測方法對云南省麗江市煙草種植區(qū)表現(xiàn)黃化、皺縮以及無癥的青蒿樣品進行病原鑒定，并對感病青蒿樣品中的TSWV的N基因和TMV的部分基因進行了克隆和序列分析，以期為麗江市金沙江流域煙草種植區(qū)內病毒病害的防治提供理論基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗材料：2022年對云南省麗江市煙草種植區(qū)進行病毒病害調查時，采集不同煙區(qū)表現(xiàn)葉片黃化、皺縮以及無癥狀的青蒿樣品（圖1，表2），新鮮樣品帶回實驗室編號后立即利用免疫金標速測卡進行病毒檢測并進行植物總RNA提取。

1.2?方法

1.2.1?總RNA提取

取約0.1?g青蒿葉片，在液氮中迅速研磨成粉末，按照Trizol總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）說明書提取青蒿葉片總RNA。

1.2.2?免疫金標速測卡檢測

按照煙草花葉病毒（TMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）免疫金標速測卡（上海佑隆生物科技有限公司）說明書進行樣品檢測，具體檢測原理與檢測步驟如下：

檢測原理：煙草花葉病毒（TMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）免疫金標速測卡應用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側向移動的過程中與膠體金標記的特異性單克隆抗體1結合，形成抗原抗體復合物，繼續(xù)向前方流動和NC膜檢測線上特異性單克隆抗體2結合形成雙抗體夾心復合物。如果樣本中抗原含量大于檢測限，檢測線顯紅色，結果為陽性;反之，檢測線不顯色，結果為陰性（圖2）。

檢測步驟：將采集的青蒿葉片按照編號分別放置于小號自封袋中并封口，利用研磨器將自封袋中樣本研磨出大量汁液，加入2?mL?磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffer?solution?tween，?PBST），繼續(xù)研磨使緩沖液與樣品汁液充分混勻，用移液槍加200?μL待檢樣品混合液至加樣口，加樣后開始計時，5～8?min后讀取結果。

1.2.3?RTPCR檢測

采用一步法對不同青蒿樣品總RNA進行反轉錄，第一鏈cDNA合成反應體系（20?μL）：20×Enzyme?Mix（Invitrogen公司）1?μL、2×RT?Buffer?Mix?10?μL、RNA?5?μL，加DEPC水定容至20?μL;

反應條件：42℃?30?min，95℃?5?min，保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，分別利用番茄斑萎病毒和煙草花葉病毒特異性引物TSWVNF/TSWVNR、TMVF/TMVR和TMVCPF/TMVCPR對青蒿樣品進行檢測（表1）。PCR反應體系（50?μL）：10×PCR?反應緩沖液（含?Mg2+）?5?μL，2.5?μmol/L

dNTPs?4?μL，20?μmol/L上、下游引物各?1?μL，5?U/μL?Taq?Plus?DNA?聚合酶（上海申能博彩生物

科技有限公司）1?μL、cDNA?2?μL，加DEPC水定容至50?μL。擴增條件：94℃預變性2?min;94℃變性45?s，50℃退火45?s，72℃延伸60?s，30個循環(huán);72℃延伸10?min。將PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，選擇目標條帶切膠，利用Axygen?DNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）進行純化回收，將回收產物與pEASYT5?Blunt?zero載體（北京全式金生物技術股份有限公司）進行連接，通過熱激轉化到大腸桿菌TransT1中后進行涂板，過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.4?數(shù)據(jù)分析

利用NCBI中BLAST（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.）進行基因序列同源性初步比較分析。利用DNAMAN（Lynnon?Biosoft，?Quebec，?Canada）和DNASTAR.?Lasergene.v7.1軟件進行開放閱讀框的查找;利用DNASTAR.?Lasergene.v?7.1軟件進行核苷酸序列比對;利用MEGA?6軟件中的鄰接法（neighborjoining）構建系統(tǒng)進化樹，自展值設置為1?000。

2?結果與分析

2.1?青蒿中番茄斑萎病毒和煙草花葉病毒檢測結果

2021年7月-2022年7月對麗江市不同煙區(qū)進行病害調查，發(fā)現(xiàn)麗江不同煙草種植區(qū)的煙田周邊均有大量青蒿雜草，采集不同煙區(qū)青蒿樣品進行病毒檢測。通過煙草花葉病毒（TMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）免疫金標速測卡對所采集的14份青蒿樣品進行檢測，結果顯示：YN550、YN551、YN693、YN571、YN583、YN682、YN832、YN833和YN839等9個青蒿樣品TSWV檢測均呈陽性，其中YN693、YN682和YN833等3份青蒿樣品TMV檢測呈陽性，其他樣品病毒檢測均呈陰性（表2）。分別可以從不同癥狀表現(xiàn)的青蒿樣品中檢測到TSWV和TMV，如表現(xiàn)黃化、卷曲、皺縮的青蒿葉片樣品YN550，表現(xiàn)黃化、卷曲的青蒿葉片樣品YN551和YN583，僅表現(xiàn)黃化的青蒿葉片樣品YN571，葉片無癥狀的青蒿樣品YN839均可檢測出TSWV;葉片表現(xiàn)黃化的青蒿樣品YN693和YN682，葉片無癥狀的青蒿樣品YN833，均可檢測出TSWV和TMV;而葉片無癥狀的青蒿樣品YN786、YN830、YN831、YN989和葉片表現(xiàn)褪綠的青蒿樣品YN797均未檢測出TSWV和TMV。

根據(jù)免疫金標速測卡檢測的結果，對3個復合侵染的青蒿樣品YN693、YN682和YN833的病毒種類進行分子鑒定。利用TSWVNF/TSWVNR（N基因序列）引物對樣品進行RTPCR檢測，結果顯示：3個樣品均能擴增出777?bp的目的片段，陰性對照無條帶，將目的片段進行切膠回收、連接轉化及測序，共獲得3條序列，分別命名為YN83351、YN6821和YN6935。利用TMVF/TMVR（RdRp部分序列）引物進行擴增，僅在YN693和YN833樣品中擴增出1?549?bp的目的片段，陰性對照無條帶，將目的片段進行切膠回收、連接轉化及測序，共獲得2條序列，分別命名為YN6934和YN83393;利用TMVCPF/TMVCPR（cp基因序列）引物進行擴增，結果在3個樣品中均能擴增出約500?bp的目的片段，陰性對照無條帶，將目的片段進行切膠回收、連接轉化及測序，共獲得3條序列，分別命名為YN68210、YN6932和YN8334（表2和表3）。

2.2?青蒿中番茄斑萎病毒和煙草花葉病毒分離物的相似性分析

利用TSWVNF/NR對青蒿樣品進行病毒擴增，共獲得3條序列分別為YN83351、YN6821和YN6935，3條序列均為完整的TSWV?N基因。通過BLAST進行序列比對，結果發(fā)現(xiàn)：3條序列均與TSWV的不同分離物相似性較高，故認為該3條序均為TSWV的不同分離物，將序列YN83351、YN6821和YN6935在NCBI上進行登錄，并獲得了登錄號（表3），3條序列之間的相似性均高于99.4%，選取TSWVYN83351進行下一步分析。將YN83351分離物N基因序列與國內外同屬的其他種或分離物N基因序列進行相似性分析，結果發(fā)現(xiàn)：YN83351分離物N基因核苷酸序列與TSWV的各個分離物的N基因核苷酸序列相似性在98.3%～99.7%之間，與云南省番茄分離物TSWV2（GenBank登錄號：MK628736.1）的相似性最高，為99.7%;而與正番茄斑萎病毒屬其他種病毒相似性在78.0%以下（表4），故認為該分離物為TSWV的一個分離物，命名為TSWVYN83351。

利用TMVF/R對青蒿樣品進行病毒擴增，共獲得2條序列，分別為YN83393和YN6934，2條序列為部分TMV?RNA依賴的RNA復制酶基因。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，2條序列均與TMV的不同分離物相似性較高，因此它們均為TMV的分離物，將2條序列YN83393和YN6934在NCBI上進行登錄，并獲得了登錄號（表3），2條序列之間的相似性高于99.7%，選取YN83393進行下一步分析。將YN83393分離物RdRp基因序列與國內外其他種或分離物RdRp基因序列進行相似性分析，結果發(fā)現(xiàn)：YN83393分離物RdRp基因核苷酸序列與TMV各分離物的RdRp基因核苷酸序列相似性在95.5%～99.6%之間，與TMV遼寧分離物Shenyang（GenBank登錄號：MG516107.1）的核苷酸序列相似性最高，為99.6%;而與煙草花葉病毒屬其他種病毒相似性在81.8%以下（表5），因此，該分離物為TMV的一個分離物，命名為TMVYN83393。

利用TMVCPF/CPR對青蒿樣品進行擴增，共獲得3條序列分別為YN8334、YN6932和YN68210，3條序列均為完整的TMV?cp基因。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)：3條序列均與TMV的不同分離物相似性較高，因此該3條序列均為TMV的分離物，將序列YN8334、YN68210和YN6932在NCBI上進行登錄，并獲得了登錄號（表3），3條序列之間的核苷酸相似性均高于99.2%，選取YN8334進行下一步分析。將YN8334分離物cp基因核苷酸序列與國內外其他種或分離物cp基因序列進行相似性分析，結果發(fā)現(xiàn)：YN8334分離物cp基因核苷酸序列與TMV各分離物的cp基因核苷酸序列相似性在95.4%～99.4%之間，與TMV遼寧分離物Shenyang（GenBank登錄號：MG516107.1）和云南分離物Yongren1（GenBank登錄號：HE818457.1）的核苷酸相似性最高，均為99.4%;而與煙草花葉病毒屬其他病毒相似性在74.8%以下（表5），因此，該分離物為TMV的一個分離物，命名為TMVYN8334。

2.3?青蒿中番茄斑萎病毒和煙草花葉病毒系統(tǒng)進化分析

由于YN833、YN682和YN693等3個樣品中均能擴增到TSWV和TMV的特異片段，且所獲核苷酸序列相似性較高，故隨機選取YN833樣品中獲得的各分離物核苷酸序列進行系統(tǒng)進化分析。將TSWVYN83351的N基因與番茄斑萎病毒不同分離物及同屬病毒N基因構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示：TSWVYN83351青蒿分離物與TSWV各個分離物聚于一個大的分支，且與云南和山東TSWV分離物聚于一個小的分支，說明TSWVYN83351青蒿分離物與云南和山東TSWV分離物親緣關系最近（圖3）。

將TMVYN83393的RdRp部分序列與煙草花葉病毒其他分離物及同屬病毒相同片段構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示：TMVYN83393青蒿分離物與TMV各分離物聚于一個大的分支，與TMV云南和遼寧分離物聚于一個小的分支，說明TMVYN83393青蒿分離物與TMV云南和遼寧分離物的親緣關系最近（圖4）。

將TMVYN8334的cp基因與煙草花葉病毒其他分離物及同屬病毒相同片段構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示：TMVYN8334青蒿分離物與TMV各分離物聚于一個大的分支，與TMV山東分離物聚于一個小的分支，說明TMVYN8334青蒿分離物與TMV山東分離物的親緣關系最近（圖5）。

3?結論與討論

本研究利用免疫金標速測卡和分子檢測方法，從云南省麗江市煙草種植區(qū)田間雜草青蒿中檢測出正番茄斑萎病毒屬病毒TSWV和煙草花葉病毒屬病毒TMV，屬于不同屬病毒復合侵染，此2種病毒為麗江市煙草種植區(qū)內造成煙草減產甚至絕產的主要病原，在無癥狀的田間雜草青蒿中也可檢測出2種病毒復合侵染，進一步證明田間雜草青蒿為重要中間寄主。

田間雜草是病毒的重要中間寄主，對病害流行有重要作用。鏟除田間雜草是一項有效的防控措施，能有效地防治TSWV［18］。目前TSWV能侵染1?000多種植物，包括凹頭莧Amaranthus?blitum、馬兜鈴Aristolochia?debilis、勝紅薊Ageratum?conyzoides、蒲公英Taraxacum?mongolicum、歐洲千里光Senecio?vulgaris、水飛薊Silybum?marianum、龍葵Solanum?nigrum、刺蒼耳Xanthium?spinosum等田間雜草，其中菊科植物就有247種，說明菊科植物為TSWV的易感寄主［1920］，本研究首次報道TSWV侵染菊科植物青蒿。TSWV青蒿分離物與云南分離物相似性較高，系統(tǒng)進化上也與云南TSWV分離物親緣關系較近。TMV是世界上發(fā)現(xiàn)和研究最早的病毒，也是第一個完成完整測序的植物病毒，可侵染番茄、煙草Nicotiana?tabacum、車前Plantago?asiatica、辣椒、茄子Solanum?melongena、姜Zingiber?officinale、蘭花Cymbidium以及豆類等350多種植物［2122］，但TMV的雜草寄主報道不多，這也是首次發(fā)現(xiàn)TMV能侵染田間雜草青蒿，TMV青蒿分離物與云南和遼寧TMV分離物相似性較高，在系統(tǒng)進化上也是與云南和遼寧TMV分離物親緣性較近。青蒿常生于煙田及周邊區(qū)域，并且青蒿受病毒侵染后會不表現(xiàn)出癥狀，因此其很可能成為作物病毒病的潛在初侵染源傳播至煙草等農作物寄主，造成病害發(fā)生流行，引起煙草等作物病毒病害。

2種病毒復合侵染往往造成更為嚴重的危害，例如在非洲，甘薯羽狀斑駁病毒（sweet?potato?feathery?mottle?virus，?SPFMV）和甘薯褪綠矮化病毒（sweet?potato?chlorotic?stunt?virus，?SPCSV）單獨侵染甘薯時并不造成危害，但當SPFMV和SPCSV復合侵染時對當?shù)馗适懋a業(yè)造成嚴重危害，并造成巨大的經(jīng)濟損失［2324］。長期以來，在病毒的研究上常常關注的是單一病毒或株系，隨著測序技術不斷的革新，發(fā)現(xiàn)2種或2種以上病毒復合侵染同一寄主植物的現(xiàn)象越來越多，2種或2種以上病毒之間可能表現(xiàn)協(xié)同作用、拮抗作用或者中性作用。在2種或2種以上病毒感染的寄主植物上常常觀察到病害癥狀更加嚴重，其中的原因主要是1種或者2種病毒的病毒積累量增加，病毒之間表現(xiàn)出協(xié)同作用［2529］。ChávezCalvillo等在研究木瓜環(huán)斑病毒（papaya?ringspot?virus，PRSV）和木瓜花葉病毒（papaya?mosaic?virus，PapMV）互作時發(fā)現(xiàn)，在先接種PRSV或PRSV和PapMV一起接種時，兩種病毒發(fā)生協(xié)同作用;在先接種PapMV后接種PRSV時，2種病毒發(fā)生拮抗作用，說明2種病毒之間的相互作用與病毒感染先后順序有關［29］。趙麗玲等在雜草凹頭莧中檢測到中國勝紅薊黃脈病毒（ageratum?yellow?vein?China?virus，AYVCNV）和云南番茄黃化曲葉病毒（tomato?yellow?leaf?curl?Yunan?virus，TYLCYnV），并通過重組分析發(fā)現(xiàn)AYVCNV凹頭莧分離物是一個重組病毒［30］。由此可見，雜草不但作為病毒侵染寄主的初侵染源，還成為病毒進化變異的重要場所。前期研究發(fā)現(xiàn)，在雜草中雖然病毒復合侵染情況較多，病毒種類也較多，但很多雜草寄主感染病毒后表現(xiàn)出的卻是無癥狀或有輕微癥狀，與該病毒在經(jīng)濟作物上所表現(xiàn)癥狀并不盡相同［3133］，本文同樣在無癥狀的青蒿樣品中鑒定出2種病毒，與前人研究結果相符。雖然在雜草中2種病毒復合侵染并不會造成更嚴重的危害，但當雜草中的多種病毒傳播到經(jīng)濟作物上則可能對經(jīng)濟作物造成嚴重危害，因此，應加強對麗江煙草種植區(qū)田間雜草中病毒監(jiān)測和病原種類鑒定，以期為麗江煙草種植區(qū)煙草病毒病防控提供科學依據(jù)。

參考文獻

［1］?MAES?P，?ALKHOVSKY?S?V，?BAO?Yiming，?et?al.?Taxonomy?of?the?family?Arenaviridae?and?the?order?Bunyavirales：?update?2018?［J］.?Archives?of?Virology，?2018，?163（8）：?22952310.

［2］?KING?A?M?Q，?ADAMS?M?J，?CARSTCNS?E?B，?et?al.?Virus?taxonomy：?ninth?report?of?the?international?committee?on?taxonomy?of?viruses?［M］.?San?Diego：?Elsevier/Academic?Press，?2012：?351373.

［3］?GUPTA?R，?KWON?S?Y，?KIM?S?T.?An?insight?into?the?tomato?spotted?wilt?virus?（TSWV），?tomato?and?thrips?interaction?［J］.?Plant?Biotechnology?Reports，?2018，?12（3）：?157163.

［4］?FERRAND?L，?ALMEIDA?M?M?S，?ORLIO?A?F，?et?al.?Biological?and?molecular?characterization?of?tomato?spotted?wilt?virus?（TSWV）?resistancebreaking?isolates?from?Argentina?［J］.?Plant?Pathology，?2019，?68（9）：?15871601.

［5］?GUNES?N，?GUMUS?M.?Detection?and?characterization?of?tomato?spotted?wilt?virus?and?cucumber?mosaic?virus?on?pepper?growing?areas?in?Antalya?［J］.?Journal?of?Agricultural?Sciences，?2019，?25（3）：?259271.

［6］?ABADKHAH?M，?KOOLIVAND?D，?EINI?O.?A?new?distinct?clade?for?Iranian?tomato?spotted?wilt?virus?isolates?based?on?the?polymerase，?nucleocapsid，?and?nonstructural?genes?［J/OL］.?The?Plant?Pathology?Journal，?2018，?34（6）：?514.?DOI：?10.5423/PPJ.OA.04.2018.0062.

［7］?鄭寬瑜，?吳闊，?董家紅，?等.?番茄斑萎病毒對云南萵苣類蔬菜的侵染危害［J］.?植物保護，?2015，?41（5）：?174178.

［8］?毛蓮珍，?趙凱，?鄧明華，?等.?云南省昆明地區(qū)番茄斑萎病毒核衣殼蛋白和運動蛋白變異分析［J］.?西北植物學報，?2019，?39（11）：?19291934.

［9］?劉佳，?陳東亮，?梁玉鐲，?等.?北京辣椒和番茄上番茄斑萎病毒的鑒定［J］.?植物檢疫，?2021，?35（2）：?4448.

［10］張萬紅，?馮佳，?KAMRAN?A，?等.?山東煙區(qū)首次發(fā)現(xiàn)番茄斑萎病毒侵染［J］.?中國煙草科學，?2020，?41（5）：?8791.

［11］康華軍，?李建設，?高艷明，?等.?寧夏銀川地區(qū)番茄斑萎病毒和南方番茄病毒復合侵染分子鑒定［J］.?中國蔬菜，?2022（4）：?2934.

［12］桂敏，?高雪，?賈志強，?等.?云南辣椒正番茄斑萎病毒屬病毒的分子鑒定［J］.?植物保護，?2022，?48（4）：?286292.

［13］JUNG?H?W，?YUN?W?S，?HAHM?Y?I，?et?al.?Characterization?of?tobacco?mosaic?virus?isolated?from?potato?showing?yellow?leaf?mosaic?and?stunting?symptoms?in?Korea?［J］.?Plant?Disease，?2002，?86（2）：?112117.

［14］KIM?B?S，?RUHL?G，?CRESWELL?T，?et?al.?Molecular?identification?of?a?tobacco?mosaic?virus?isolate?from?imported?petunias?［J］.?Plant?Health?Progress，?2014，?15（4）：?153154.

［15］YANG?Jinguang，?WANG?Fenglong，?CHEN?Dexin，?et?al.?Development?of?a?onestep?immunocapture?realtime?RTPCR?assay?for?detection?of?tobacco?mosaic?virus?in?soil?［J］.?Sensors，?2012，?12（12）：?1668516694.

［16］SCHOLTHOF?K?B?G，?ADKINS?S，?CZOSNEK?H，?et?al.?Top?10?plant?viruses?in?molecular?plant?pathology?［J］.?Molecular?Plant?Pathology，?2011，?12（9）：?938954.

［17］中國醫(yī)藥信息查詢平臺［DB/OL］.?［20221117］.?https：∥www.dayi.org.cn/cmedical/1008545.

［18］MARCHOUX?G，?HOSTACHY?B，?GEBRE?S?K，?et?al.?Tomato?spotted?wilt?virus：?htes?et?méthodes?delutte?［J］.PHMRevue?Horticole，?2000，?418：?4652.

［19］PARRELLA?G，?GOGNALONS?P，?GEBRE?S?K，?et?al.?An?update?of?the?host?range?of?tomato?spotted?wilt?virus?［J］.?Journal?of?Plant?Pathology，?2003，?85（4）：?227264.

［20］MORCA?A?F，?ELIK?A，?COSKAN?S，?et?al.?Population?analysis?on?tomato?spotted?wilt?virus?isolates?inducing?various?symptoms?on?tomato，?pepper，?and?Chenopodium?album?in?Turkey?［J/OL］.?Physiological?and?Molecular?Plant?Pathology，?2022，?118：?101786.?DOI：?10.1016/j.pmpp.2022.101786.

［21］OSHIMA?N，?OHASHI?Y，?UMEKAWA?M.?Studies?on?some?strains?of?tobacco?mosaic?virus?pathogenic?to?crucifer?plants?2.?Host?range?［J］.?Japanese?Journal?of?Phytopathology，?1974，?40（3）：?243251.

［22］ALISHIRI?A，?RAKHSHANDEHROO?F，?ZAMANIZADEH?H?R，?et?al.?Prevalence?of?tobacco?mosaic?virus?in?Iran?and?evolutionary?analyses?of?the?coat?protein?gene?［J］.?Plant?Pathology?Journal，?2013，?29（3）：?260273.

［23］SCHAEFERS?G?A，?TERRY?E?R.?Insect?transmission?of?sweet?potato?disease?agents?in?Nigeria?［J］.?Phytopathology，?1976，?66（5）：?642645.

［24］KARYEIJA?R?F，?KREUZE?J?F，?GIBSON?R?W，?et?al.?Synergistic?interactions?of?a?potyvirus?and?a?phloemlimited?crinivirus?in?sweet?potato?plants?［J］.?Virology，?2000，?269（1）：?2636.

［25］SYLLER?J.?Facilitative?and?antagonistic?interactions?between?plant?viruses?in?mixed?infections?［J］.?Molecular?Plant?Pathology，?2012，?13（2）：?204216.

［26］UNTIVEROS?M，?FUENTES?S，?SALAZAR?L?F.?Synergistic?interaction?of?sweet?potato?chlorotic?stunt?virus?（Crinivirus）?with?carla，?cucumo，?ipomo，?and?potyviruses?infecting?sweet?potato?［J］.?Plant?Disease，?2007，?91（6）：?669676.

［27］MASCIA?T，?GALLITELLI?D.?Synergies?and?antagonisms?in?virus?interactions?［J］.?Plant?Science，?2016，?252：?176192.

［28］TATINENI?S，?ALEXANDER?J，?GUPTA?A?K，?et?al.?Asymmetry?in?synergistic?interaction?between?wheat?streak?mosaic?virus?and?triticum?mosaic?virus?in?wheat?［J］.?Molecular?PlantMicrobe?Interactions，?2019，?32（3）：?336350.

［29］CHAVEZCALVILLO?G，?CONTRERAS?P?C?A，?MORA?M?J，?et?al.?Antagonism?or?synergism?between?papaya?ringspot?virus?and?papaya?mosaic?virus?in?Carica?papaya?is?determined?by?their?order?of?infection?［J］.?Virology，?2016，?489（9）：?179191.

［30］趙麗玲，?鐘靜，?尹躍艷，?等.?云南凹頭莧上分離到的2種菜豆金色花葉病毒屬病毒基因組結構特征［J］.?植物病理學報，?2017，?47（6）：?738746.

［31］SAMPANGI?R?K，?MOHAN?S?K，?PAPPU?H?R.?Identification?of?new?alternative?weed?hosts?for?iris?yellow?spot?virus?in?the?Pacific?Northwest?［J］.?Plant?Disease，?2007，?91（12）：?1683.

［32］PAPAYIANNIS?L?C，?KATIS?N?I，?IDRIS?A?M，?et?al.?Identification?of?weed?hosts?of?tomato?yellow?leaf?curl?virus?in?Cyprus?［J］.?Plant?disease，?2011，?95（2）：?120125.

［33］HOSSEINI?S?A，?SALARI?K.?Detection?and?molecular?characterisation?of?potato?virus?S?of?weed?reservoirs?in?Iran?［J］.?Archives?of?Phytopathology?and?Plant?Protection，?2017，?50（15/16）：?828838.

（責任編輯：田?喆）