肖秋萍，黃佳琦，萬琪，施旻，李姍姍，劉端勇，陳麗玲，鐘友寶，（.江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心，江西 南昌 0004；.江西中醫(yī)藥大學研究生院，江西 南昌 0004；.江西中醫(yī)藥大學方證研究中心，江西 南昌 0004）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）包括克羅恩?。╟rohn’s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC），屬于慢性非特異性腸道炎癥[1]；在中醫(yī)理論中屬于“痢疾”“久痢”等范疇[2]。隨著工業(yè)化快速發(fā)展、飲食結(jié)構(gòu)西方化，我國潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率和復發(fā)率逐年攀升[3]。潰瘍性結(jié)腸炎臨床上反復發(fā)作且難以徹底治愈，世界衛(wèi)生組織（WHO）已將潰瘍性結(jié)腸炎列為十大難治性疾病之一[4]。氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、新型免疫抑制劑等藥物廣泛用于快速緩解潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，但其療效不足、治愈率低、藥物依賴性大、費用高等局限性導致潰瘍性結(jié)腸炎治療仍是醫(yī)療的重大挑戰(zhàn)[5]。因而，尋找更加安全、有效、可靠的治療藥物已然迫在眉睫。

補脾益腸丸（BupiYichangPills）是臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎的常用方劑，主治潰瘍性結(jié)腸炎、慢性結(jié)腸炎等[6]。納入835 例潰瘍性結(jié)腸炎患者的Meta 分析結(jié)果[15]顯示，補脾益腸丸聯(lián)合常規(guī)療法干預潰瘍性結(jié)腸炎能提高臨床總有效率，減少不良反應，并改善結(jié)腸黏膜癥狀評分。在單一用藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的案例[7]中，補脾益腸丸臨床療效明顯優(yōu)于西藥組，腹痛、腹瀉、黏液便等癥狀明顯改善，然而其具體作用機制尚未見報道。

據(jù)研究[8]報道，糖酵解信號通路在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展中扮演關鍵性角色。潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道黏膜受損，糖酵解相關酶活性和基因表達明顯增加，而過度激活的糖酵解會加重潰瘍性結(jié)腸炎患者能量代謝紊亂[9]。此外，糖酵解信號通路與炎癥反應密切相關，可通過多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應進程[10]。中醫(yī)藥可通過干預糖酵解代謝途徑，改善腸道炎性環(huán)境從而有效緩解潰瘍性結(jié)腸炎[11]；如清腸溫中方可通過抑制糖酵解代謝而調(diào)控CD4+TRM 細胞免疫穩(wěn)態(tài)有效治療潰瘍性結(jié)腸炎[12]。潰瘍性結(jié)腸炎的典型特征是病情遷延不愈、反復發(fā)作[13-14]，降低復發(fā)率是治療關鍵，而有報道稱補脾益腸丸治療潰瘍性結(jié)腸炎不僅療效好且復發(fā)率低[15]。

本研究旨在基于糖酵解途徑，擬采用復發(fā)性結(jié)腸炎模型揭示補脾益腸丸緩解潰瘍性結(jié)腸炎并抑制復發(fā)的具體作用機制，以期為補脾益腸丸治療潰瘍性結(jié)腸炎提供科學依據(jù)，并豐富中醫(yī)理論內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 動物7～8 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，體質(zhì)量20～24 g（動物質(zhì)量合格證號： 202132170），購于南京集萃藥康公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。動物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心屏障環(huán)境內(nèi)。小鼠自由飲水，采食標準全價飼料，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24℃，濕度50%～60%。本研究方案得到江西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的批準，批準號：JZLLSC2020-234，整個實驗操作過程遵守實驗動物標準操作規(guī)范。

1.2 藥物及試劑補脾益腸丸，購于白云山陳李濟藥廠有限公司，批號：K05190，組方為黃芪、米炒黨參、砂仁、白芍、當歸、白術(shù)、肉桂、醋延胡索、荔枝核、炮姜、炙甘草、防風、木香、鹽補骨脂、煅赤石脂；葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS；分子量36～50 kDa），批號：160110，購于美國MP Biomedicals 公司；美沙拉嗪（Mesalazine，5-ASA，批號：89-57-6），購于美國Sigma-Aldrich公司；戊巴比妥鈉（批號：1014P035），購于美國Sigma 公司；M5 HiPer Universal RNA Mini Kit（批號：MF167）、M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover（批號：MF166）、SYBRgreen Mix（批號：MF-015），均購于北京聚合美生物技術(shù)有限公司；小鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α（批號：88-7324-88）、白細胞介素（IL）-1β（批號：BMS6002）、IL-6（批號：88-7064-22）、IL-10（批號：88-7105-22）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1（批號：BMS608-4）酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，均購于美國Thermo Scientific 公司；IL-35酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（批號：E-EL-H2443c），購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Anti-PKM2抗體（批號：ab137791）、Anti-Aldolase 抗體（批號：ab252953）、Anti-Glut1 抗體（批號：ab115730）、Anti-Glut4 抗體（批號：ab313775）、Anti-HK2 抗體（批號： ab209847）、 Anti- Glut2 抗體（批號：ab54460），均購于英國Abcam公司。

1.3 主要儀器HistoCore_Arcadia 型全自動包埋機、Leica2245 型石蠟切片機、DM2500 型多人共覽顯微鏡，德國Leica 公司；Multiskan Spectrum 型全波長酶標儀，美國Thermo 公司；Milli-Q Advantage A10 型超純水儀，美國密理博公司；LightCycle 96型熒光定量PCR 儀，瑞士Roche 公司；UVP ChemStudio 型化學發(fā)光成像儀，德國Analytikjena公司。

1.4 方法

1.4.1 潰瘍性結(jié)腸炎模型建立及給藥 小鼠適應性飼養(yǎng)3 d，隨機分成空白對照組，模型組，低、中、高劑量補脾益腸丸組，美沙拉嗪組，空白補脾益腸丸組。潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立[12]：模型組和低、中、高劑量補脾益腸丸組、美沙拉嗪組小鼠于實驗第0～7 天和第14～21 天自由飲用2.5% DSS 溶液，第7～14 天自由飲水。補脾益腸丸和美沙拉嗪預先溶解于生理鹽水，根據(jù)補脾益腸丸臨床劑量（每天3 次，每次6.0 g）[6]及體表面積換算[16]，低、中、高劑量補脾益腸丸組和空白補脾益腸丸組小鼠于實驗第7～21天分別灌胃1.5、3.0、6.0、6.0 g·kg-1·d-1補脾益腸丸[17]，美沙拉嗪組小鼠灌胃300 mg·kg-1·d-1美沙拉嗪，而空白對照組及模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水。

1.4.2 疾病活動指數(shù)（disease active index，DAI） 整個實驗過程，每天同時間各組小鼠稱質(zhì)量并觀察糞便黏稠度、便血情況，根據(jù)公式計算：DAI=體質(zhì)量損失評分+糞便黏稠度評分+便血情況評分，DAI評價標準參考以往研究[18]。

1.4.3 結(jié)腸長度、質(zhì)量及指數(shù) 小鼠于實驗第21天采用2%戊巴比妥鈉深度麻醉安樂死，迅速打開腹腔并分離整個結(jié)腸，測量結(jié)腸長度；預冷的PBS溶液清洗腸腔內(nèi)容物，濾紙吸干，結(jié)腸稱質(zhì)量并計算結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)（結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)=結(jié)腸質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%）。

1.4.4 病理組織技術(shù)分析結(jié)腸損傷 取近端結(jié)腸2 cm，置于4%多聚甲醛溶液中固定，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成4 μm 切片。常規(guī)蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色，在光學顯微鏡下采集圖片，基于炎性細胞浸潤和潰瘍形成[13]，由2 位病理學老師隨機、盲法對結(jié)腸病理圖片進行病理損傷評分。

1.4.5 Elisa 法檢測炎性細胞因子水平 RIPA 溶液裂解結(jié)腸組織，組織勻漿均質(zhì)化，離心取上清液。BCA法檢測上清總蛋白濃度，1×PBS標準化至2 000 ng·mL-1。根據(jù)Elisa 法檢測試劑盒說明，檢測結(jié)腸組織促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和抗炎性細胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 濃度，酶標儀讀取450 nm 處吸光度值，基于標準曲線計算細胞因子濃度。

1.4.6 qPCR 法檢測炎性細胞因子及糖酵解激酶基因表達 提取結(jié)腸組織總RNA，酶標儀檢測總RNA 濃度，普通瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBRgreen Mix 試劑盒進行實時熒光定量檢測，具體步驟參照試劑盒說明書?；蛎Q和引物序列見表1，qPCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以GAPDH 為管家基因，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算炎性細胞因子及糖酵解激酶基因的表達水平。

表1 基因名稱及引物序列Table 1 Gene names and primer sequences

1.4.7 Western Blot法檢測糖酵解激酶蛋白表達 RIPA裂解組織結(jié)腸組織，組織勻漿，破碎儀均質(zhì)化，4 ℃、13 000×g離心10 min，收集上清液。BCA法檢測總蛋白濃度，標準化至3 000 ng·mL-1，加Loading buffer沸騰10 min。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，120 V條件下電泳；200 mA 條件下轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉；一抗（Glut1，Glut2，Glut4，HK2，Aldolase A，PKM2）4 ℃孵育過夜，相應二抗特異性結(jié)合，ECL發(fā)光液顯影，化學發(fā)光成像儀可視化成像。

1.5 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 補脾益腸丸抑制DSS誘導的潰瘍性結(jié)腸炎DSS誘導的結(jié)腸炎可模擬人類結(jié)腸炎發(fā)病過程，常用于潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制及抗結(jié)腸炎新藥研發(fā)[19]。在整個研究過程中，觀察到DSS誘導的結(jié)腸炎小鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量、腹瀉、便血等情況表現(xiàn)出先變差再轉(zhuǎn)好繼而變差的現(xiàn)象，而DAI評分亦呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢（圖1）。與空白對照組比較，模型組結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度均明顯下降（P＜0.01），DAI、結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)、單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)明顯上升（P＜0.01）（圖1、表2）。光學顯微鏡下觀察到模型組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜上皮破損脫落、大量潰瘍形成和炎性細胞浸潤（圖2），其組織病理損傷評分（表2）明顯高于空白對照組（P＜0.01）。這些結(jié)果表明DSS成功誘導了小鼠實驗性結(jié)腸炎，且癥狀出現(xiàn)復發(fā)性。

圖1 各組小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）和結(jié)腸長度Figure 1 Disease activity index（DAI）and colonic length of mice in each group

圖2 補脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織損傷（HE 染色）Figure 2 Bupi Yichang Pills inhibited colonic tissue damage in colitis mice（HE staining）

表2 補脾益腸丸對結(jié)腸炎小鼠的療效評價（±s，n=10）Table 2 Therapeutic evaluation of Bupi Yichang Pills on colitis mice（±s，n=10）

表2 補脾益腸丸對結(jié)腸炎小鼠的療效評價（±s，n=10）Table 2 Therapeutic evaluation of Bupi Yichang Pills on colitis mice（±s，n=10）

注：與空白對照組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型組低劑量補脾益腸丸組中劑量補脾益腸丸組高劑量補脾益腸丸組美沙拉嗪組空白補脾益腸丸組結(jié)腸組織病理損傷評分/分0.20±0.04 5.11±0.74**3.80±1.17#2.60±0.92##1.91±0.67##2.36±0.77##0.10±0.30劑量/(g·kg-1)--1.5 3.0 6.0 0.3 6.0體質(zhì)量/g 25.30±1.12 21.22±1.13**22.56±1.29#23.69±1.32##24.03±1.41##23.77±1.35##25.14±1.12結(jié)腸質(zhì)量/g 0.24±0.02 0.34±0.04**0.31±0.03 0.28±0.03##0.26±0.03##0.27±0.03##0.25±0.02結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)/%0.95±0.09 1.60±0.20**1.37±0.14#1.18±0.16##1.08±0.19##1.14±0.21##1.00±0.10結(jié)腸長度/cm 8.79±0.32 7.36±0.43**7.68±0.51 7.83±0.42#8.03±0.39##7.89±0.43##8.65±0.40單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)/%2.73±0.36 4.62±0.57**4.04±0.49#3.58±0.52##3.24±0.48##3.42±0.51##2.89±0.36

由圖1 和表2 可知，與模型組比較，低、中、高劑量補脾益腸丸組和美沙拉嗪組小鼠體質(zhì)量明顯上升（P＜0.05，P＜0.01），而DAI、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)、單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)明顯性下降（P＜0.05，P＜0.01）；此外，中、高劑量補脾益腸丸組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸質(zhì)量明顯低于模型組（P＜0.01），而結(jié)腸長度明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。觀察病理組織發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量補脾益腸丸和美沙拉嗪給藥處理的結(jié)腸炎小鼠，結(jié)腸黏膜上皮較完整且潰瘍形成和炎性細胞浸潤較少（圖2），其組織病理損傷評分（表2）明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。此外，空白補脾益腸丸組小鼠的體質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)、結(jié)腸長度、單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這些結(jié)果表明補脾益腸丸可有效地抑制DSS誘導的結(jié)腸炎，療效呈劑量依賴性。

2.2 補脾益腸丸抑制促炎性細胞因子的表達促炎性（TNF-α、IL-1β 和IL-6）和抗炎性細胞因子（IL-10、IL-35 和TGF-β1）之間的平衡決定著結(jié)腸炎發(fā)病和緩解的進程[20]。由表3 可知，模型組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 水平和濃度均明顯高于空白對照組（P＜0.01）。與模型組比較，除低劑量補脾益腸丸組的TNF-α 濃度外（P＞0.05），各劑量補脾益腸丸組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 水平和濃度均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。此外，與空白對照組比較，空白補脾益腸丸組TNF-α、IL-1β和IL-6 的mRNA 水平和濃度的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這些結(jié)果表明補脾益腸丸抑制了結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中促炎性細胞因子的表達。

表3 補脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中促炎性細胞因子表達（±s，n=6）Table 3 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

表3 補脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中促炎性細胞因子表達（±s，n=6）Table 3 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型組低劑量補脾益腸丸組中劑量補脾益腸丸組高劑量補脾益腸丸組美沙拉嗪組空白補脾益腸丸組劑量/（g·kg-1）mRNA水平（以GAPDH為內(nèi)參）濃度/（pg·mL-1）IL-6 975.26±62.13 1423.23±132.23**1225.13±92.53#1054.55±86.29##903.12±85.21##1033.22±104.52##1042.13±121.23--1.5 3.0 6.0 0.3 6.0 TNF-α 1.15±0.24 4.25±0.93**3.25±0.75#2.63±0.54##1.92±0.32##2.04±0.51##1.33±0.35 IL-1β 1.33±0.41 4.62±0.91**3.11±0.79##2.54±0.61##1.61±0.46##2.27±0.51##1.72±0.53 IL-6 0.92±0.25 2.48±0.57**2.14±0.51##1.71±0.37##0.89±0.41##1.25±0.31##0.25±0.03**TNF-ɑ 92.2±5.21 230.11±19.53**216.23±23.72 180.25±16.71##150.33±15.52##140.25±20.10##95.81±9.82 IL-1β 113.02±26.28 270.25±30.15**221.45±31.32#188.75±26.31##167.35±24.57##203.12±20.15##102.45±18.62

2.3 補脾益腸丸促進抗炎性細胞因子的表達由表4可知，模型組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中抗炎性細胞因子IL-10、IL-35和TGF-β1的mRNA 水平及濃度均明顯低于空白對照組（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量補脾益腸丸組及美沙拉嗪組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的IL-10 和TGF-β1 的mRNA 水平及濃度均明顯上升（P＜0.01），且中、高劑量補脾益腸丸組及美沙拉嗪組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的IL-35 的mRNA 水平及濃度均明顯上升（P＜0.01）。這些結(jié)果表明補脾益腸丸可促進結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中抗炎性細胞因子表達。

表4 補脾益腸丸促進結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中抗炎性細胞因子表達（±s，n=6）Table 4 Bupi Yichang Pills promoted the expression of anti-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

表4 補脾益腸丸促進結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中抗炎性細胞因子表達（±s，n=6）Table 4 Bupi Yichang Pills promoted the expression of anti-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白對照組模型組低劑量補脾益腸丸組中劑量補脾益腸丸組高劑量補脾益腸丸組美沙拉嗪組空白補脾益腸丸組劑量/（g·kg-1）mRNA水平（以GAPDH為內(nèi)參）濃度/（pg·mL-1）TGF-β1 75.23±9.36 20.11±3.56**26.36±3.89##35.51±4.22##40.56±5.87##38.44±5.21##80.23±10.95--1.5 3.0 6.0 0.3 6.0 IL-10 1.29±0.21 0.13±0.02**0.25±0.03##0.38±0.04##0.52±0.06##0.62±0.07##1.57±0.36 IL-35 1.15±0.19 0.31±0.04**0.35±0.05 0.48±0.04##0.67±0.11##0.57±0.09##0.98±0.14 TGF-β1 0.97±0.22 0.26±0.05**0.47±0.06##0.61±0.11##0.77±0.14##0.52±0.09##1.24±0.21*IL-10 26.21±3.56 5.32±0.74**7.12±1.13##9.65±1.67##11.35±2.03##10.36±1.87##30.22±4.32 IL-35 1.53±0.22 0.55±0.08**0.61±0.09 0.85±0.12##0.93±0.19##0.89±0.15##1.39±0.21

2.4 補脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶基因表達結(jié)腸組織伴隨著糖酵解過度活化的能量代謝紊亂是結(jié)腸炎發(fā)病的典型特征之一[21]。見表5，與空白對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Pfkm、PEPCK2、Aldolase A 和PKM2的mRNA 水平明顯上升（P＜0.01）。高劑量補脾益腸丸給藥處理后明顯降低了Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A和PKM2的mRNA水平（P＜0.01）。

表5 補脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶基因的表達（±s，n=6）Table 5 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic metabolic kinase gene in colitis mice（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白對照組模型組高劑量補脾益腸丸組空白補脾益腸丸組劑量/（g·kg-1）mRNA的相對表達量PKM2 1.13±0.17 4.87±0.67**2.14±0.41##1.23±0.26--6.0 6.0 Glut1 1.05±0.15 4.52±1.32**1.47±0.23##0.89±0.22 Glut2 1.22±0.20 6.08±0.66**1.81±0.29##1.42±0.33 Glut4 0.95±0.17 21.35±3.05**3.87±0.48##1.32±0.41 HK2 1.13±0.26 11.32±2.53**3.95±0.42##2.87±0.61**Pfkm 1.18±0.18 2.64±0.55**2.35±0.62 1.36±0.34 PEPCK2 1.13±0.21 3.44±0.94**2.66±0.89 0.93±0.21 Aldolase A 0.91±0.22 3.35±0.72**1.23±0.21##0.82±0.16

2.5 補脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶蛋白表達由圖3 及表6 可知，模型組結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織中糖酵解激酶Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A、PKM2 蛋白水平明顯高于空白對照組（P＜0.05，P＜0.01）；補脾益腸丸給藥處理后，高劑量補脾益腸丸組的Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A、PKM2 蛋白水平均明顯低于模型組（P＜0.01）。這些結(jié)果表明補脾益腸丸可抑制DSS 誘導的結(jié)腸炎小鼠糖酵解途徑活化。

圖3 補脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶蛋白表達Figure 3 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic kinase protein in colitis mice

表6 補脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶蛋白表達（±s，n=3）Table 6 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic kinase in colitis mice（±s，n=3）

表6 補脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶蛋白表達（±s，n=3）Table 6 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic kinase in colitis mice（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白對照組模型組高劑量補脾益腸丸組空白補脾益腸丸組劑量/（g·kg-1）以GAPDH為內(nèi)參的蛋白相對表達量PKM2 0.53±0.17 0.77±0.21*0.43±0.11##0.24±0.05**--6.0 6.0 Glut1 2.15±0.39 3.08±0.18**2.02±0.21##1.92±0.36 Glut2 0.38±0.04 0.95±0.28**0.33±0.04##0.36±0.03 Glut4 0.89±0.14 1.42±0.23**0.91±0.21##1.03±0.28 HK2 0.91±0.24 1.62±0.29**0.89±0.23##0.88±0.36 Aldolase A 1.58±0.19 2.54±0.31**1.35±0.17##1.42±1.20

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)辨證分型為大腸濕熱、肝郁脾虛、脾氣虛弱、脾腎陽虛等不同證型[22]。脾虛氣滯型潰瘍性結(jié)腸炎是由于脾胃氣虛導致中焦運化失常，進而引發(fā)痢疾和泄瀉；其患者出現(xiàn)的慢性腹瀉、黏液便或膿血便、腹痛、里急后重等癥狀呈慢性反復發(fā)作或持續(xù)性，并伴有神疲乏力、納谷不香、口淡不渴、舌淡胖大、苔白膩、脈緩弱等特征，屬于本虛標實的證候[23]。補脾益腸丸常用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、慢性結(jié)腸炎脾虛氣滯所致的泄瀉證候[6]。補脾益腸丸含內(nèi)外2層，外層以黃芪、黨參等七味益氣藥為主，針對腹瀉、神疲乏力等脾胃虛弱癥狀而專補脾氣；內(nèi)層以延胡索、赤石脂等八味行氣止瀉藥為主，針對泄瀉里急后重、下痢膿血等結(jié)腸炎典型癥狀而重在止瀉。在本研究中觀察到小鼠結(jié)腸炎癥狀出現(xiàn)了首發(fā)、緩解與復發(fā)，表現(xiàn)為小鼠精神狀態(tài)、腹瀉等癥狀及DAI評分由差轉(zhuǎn)好再轉(zhuǎn)差的現(xiàn)象，說明此模型具有復發(fā)性結(jié)腸炎特征；而補脾益腸丸呈劑量賴性地有效緩解DSS誘導的實驗性結(jié)腸炎相關癥狀，明顯逆轉(zhuǎn)小鼠體質(zhì)量減輕、結(jié)腸長度縮短、結(jié)腸質(zhì)量增加、單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)上升及結(jié)腸黏膜組織損傷。美沙拉嗪是治療輕、中度潰瘍性結(jié)腸炎患者的首選藥物，也常作為陽性對照藥評估新型抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物的療效[24]。我們發(fā)現(xiàn)高劑量補脾益腸丸對結(jié)腸炎小鼠的療效與陽性對照藥美沙拉嗪效果相近，進一步展示了補脾益腸丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛力。

補脾益腸丸中，黃芪與黨參為君藥，黨參益氣健脾和胃，黃芪補中益氣，托毒排膿，養(yǎng)血生肌。白術(shù)、砂仁為臣藥，共助君藥健脾理氣，祛除因脾虛所致體內(nèi)濕停。肉桂、干姜溫中止痛，補骨脂溫補脾腎，白芍、當歸養(yǎng)血調(diào)血，延胡索、荔枝核、木香行氣止痛，符合治痢思想。赤石脂澀腸止瀉止血，防風祛風散濕，甘草調(diào)和諸藥。全方組方嚴謹，通過健脾和胃、補益氣血，調(diào)節(jié)機體平衡，有效改善潰瘍性結(jié)腸炎引起的臨床癥狀。細胞因子風暴是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的典型特征，表現(xiàn)為促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6過度分泌，而抗炎因子IL-10、IL-35、TGF-β1 低表達[25]。臨床研究[26]表明，靶向阻斷細胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6），有助于緩解持續(xù)的結(jié)腸黏膜炎癥。黃芪、黨參的有效組分黃芪多糖、黨參多糖可有效抑制促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達[27-28]。本研究中，結(jié)腸炎小鼠經(jīng)補脾益腸丸口服給藥，結(jié)腸組織中促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6濃度呈劑量依賴性下降，而抗炎性細胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 呈劑量依賴性上升，表明補脾益腸丸可有效抑制結(jié)腸炎癥反應。

中醫(yī)認為，脾主運化水谷精微，是人體生化過程的基礎，而脾胃功能失調(diào)是潰瘍性結(jié)腸炎的主要病機之一?，F(xiàn)代生理學則認為，能量代謝是一切生命活動的基礎。水谷作為能量的來源，通過新陳代謝轉(zhuǎn)化能量以維持人體的正常生命活動；而糖酵解是能量代謝中不可缺少的環(huán)節(jié)。單樣本基因組富集分析顯示，與健康對照組比較，IBD 腸道樣本中的糖酵解明顯升高[29]；腸道上皮細胞能量代謝出現(xiàn)重編程，糖酵解代謝過度活化以維持慢性炎癥[30]。能量代謝重編程在慢性結(jié)腸炎的發(fā)展過程中扮演關鍵性角色，特征為葡萄糖的極劇消耗，糖酵解的活性增強[31]，Glut、LDHA、PFK、PKM2 酶活性過度活化，炎性因子IL-6 高表達；并且能量代謝方式異常與活躍的黏膜炎癥密切相關[32]。研究[33-34]發(fā)現(xiàn)，在DSS 誘導的慢性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中，糖酵解關鍵酶HK2、LDHA、PFK、PKM2 表達升高，炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6等含量亦升高。臨床上小分子靶向干預葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白及糖酵解代謝關鍵激酶（包括Glut、HK、PKM2）能有效調(diào)節(jié)炎性細胞因子表達，表明干預能量代謝途徑是抑制腸道炎癥反應的有效措施[35]。而中藥成分黃芪皂苷能明顯下調(diào)結(jié)腸炎小鼠有氧糖酵解途徑及LDH、Glut、HK2、c-Myc 蛋白表達，并減弱炎癥反應[36]。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)補脾益腸丸也能抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解代謝，表現(xiàn)為Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A 和PKM2 蛋白及基因表達水平明顯下降，炎性細胞因子基因表達及含量被調(diào)節(jié)；而補脾益腸丸對正常小鼠的糖酵解代謝激酶表達及炎性細胞因子水平均無明顯影響，這表明糖酵解代謝途徑是補脾益腸丸抗結(jié)腸炎的關鍵作用靶點。

綜上所述，補脾益腸丸對DSS誘導的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有明顯的保護性作用。補脾益腸丸可明顯抑制結(jié)腸組織中促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達，且促進抗炎細胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 表達，這與其抑制糖酵解信號通路密切相關。本研究闡釋了補脾益腸丸通過抑制糖酵解代謝通路抗結(jié)腸炎的作用機制，可為補脾益腸丸臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎提供科學依據(jù)。