鄭馬強,馬智聰

(1山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail：mazhicong1970@126.com)

艾司氯胺酮(esketamine, Ket)是臨床上常用的一種靜脈麻醉藥,主要通過非競爭性拮抗N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate-receptor,NMDAR)阻斷興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)來發(fā)揮全身麻醉作用。艾司氯胺酮作為氯胺酮的對映異構(gòu)體,它與NMDAR具有更強的結(jié)合力,從而能發(fā)揮更強的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用,且對呼吸和循環(huán)的抑制小,蘇醒更快,此外它還具有神經(jīng)保護作用[1]。有研究指出,NMDAR在骨重塑方面也發(fā)揮了一定的作用,并參與了骨代謝的過程[2],然而其確切作用尚不明確。成骨細(xì)胞作為骨形成過程中的主要功能細(xì)胞,可通過特異性分泌多種生物活性物質(zhì)調(diào)控骨基質(zhì)的合成、重塑和愈合過程[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)艾司氯胺酮可促進小鼠成骨細(xì)胞的增殖及分化[4],而艾司氯胺酮主要通過作用于NMDAR而發(fā)揮其效應(yīng),因此本實驗通過觀察艾司氯胺酮和NMDAR激動劑對小鼠成骨細(xì)胞增殖及分化的影響,探討艾司氯胺酮作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 4周齡C57BL/6雄性小鼠,購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理研究委員會審查并批準(zhǔn)(DW2023002)。

1.1.2 主要試劑 NMDA(貨號：B1624,美國Apexbio公司);鹽酸艾司氯胺酮溶液(規(guī)格：50 mg/2 mL,批號：221109BL,江蘇恒瑞公司);α-MEM培養(yǎng)基(貨號：SH30265.01,美國Hyclone公司);胎牛血清(貨號：11011-8611,美國Gibco公司);青鏈霉素混合液(貨號：P1400,中國北京索萊寶公司);胰蛋白酶-EDTA(0.25%含酚紅)(貨號：T1300,美國Gibco公司);地塞米松(貨號：D4902,中國上海Sigma Aldrich公司);L-抗壞血酸(貨號：A4403,中國上海Sigma Aldrich公司);β-甘油磷酸(貨號：G806967,中國上海麥克林公司);BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(貨號：c3206,中國上海碧云天公司);ELISA試劑盒(貨號：JL13034,中國上海江萊公司);總蛋白提取試劑盒(貨號：EX1100,中國北京索萊寶公司);TRIzol RNA提取液(貨號：RR036A,中國武漢Servicebio公司)等。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺購自中國江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;CO2培養(yǎng)箱購自德國Heracell公司;離心機購自美國Thermo Fisher公司;LX800酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司;熒光定量PCR儀購自美國Biord公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)和培養(yǎng) 參考田虹等[5]的方法進行成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng),取4周齡C57BL/6雄性小鼠,頸部脫臼法處死后,置于5%乙醇中浸泡5 min消毒處理。于超凈工作臺中剝離肌肉和組織,取雙側(cè)股骨及脛骨,用PBS重復(fù)洗滌2次,剪去骨骺端,然后用無菌注射器吸取含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基,把股骨及脛骨中的骨髓液緩慢沖洗到細(xì)胞培養(yǎng)皿中,反復(fù)沖洗直至骨髓腔發(fā)白為止。吹打混勻細(xì)胞后置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中,隔日換液,棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中漂浮的細(xì)胞,貼壁的細(xì)胞即為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度長至80%融合時,按照1∶2的比例進行傳代培養(yǎng)。接種后更換為含10%胎牛血清,10 nmol/L地塞米松,50 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油酸鈉的成骨細(xì)胞培養(yǎng)基[6]進行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d左右后,將其接種于置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,根據(jù)堿性磷酸酯酶試劑盒說明書,對細(xì)胞進行堿性磷酸酶染色。在顯微鏡下隨機選取5個視野觀察染色結(jié)果,陽性細(xì)胞可見藍紫色顆粒沉積在胞質(zhì)堿性磷酸酶活性部位,證明同批細(xì)胞為所需成骨細(xì)胞,可用于后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞毒性實驗檢測細(xì)胞活性 將成骨細(xì)胞以每孔5 000～10 000個的細(xì)胞密度接種于96孔板中,每孔加入100 μL含10%胎牛血清的成骨細(xì)胞培養(yǎng)基。于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞貼壁后在各孔中加入含不同濃度NMDA(0,6.25,12.5,25,50,100,200 μmol/L)的成骨細(xì)胞培養(yǎng)基。每組設(shè)3個復(fù)孔,待干預(yù)24,48,72,96 h后,于每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中避光孵育2 h后,使用酶標(biāo)儀檢測各組波長在450 nm處的吸光度值(OD值)并記錄結(jié)果,計算平均OD值并繪圖。

1.2.3 細(xì)胞分組與干預(yù) 成骨細(xì)胞傳代貼壁24 h后,將其隨機分為3組：對照組、Ket組和Ket+NMDA組。對照組、Ket組和Ket+NMDA組分別用含10%胎牛血清、100 μmol/L Ket、100 μmol/L Ket和100 μmol/L NMDA的成骨細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。隨后置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72 h。

1.2.4 熒光定量PCR(qPCR)法檢測Runx2和Osterix的相對表達水平 棄掉舊培養(yǎng)基,用TRIzol法分別提取成骨細(xì)胞中的總RNA,采用qPCR法分別檢測同一時間點Runx2和Osterix的mRNA的相對表達水平。本實驗PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,進行40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參進行校正,采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達水平,引物序列見表1。

表1 目的基因特異性引物序列

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測Bcl-2、Bax以及BDNF蛋白的表達量 采用總蛋白提取液分別提取成骨細(xì)胞中的蛋白質(zhì),按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒操作步驟檢測成骨細(xì)胞中Bcl-2、Bax以及BDNF蛋白的表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞鑒定結(jié)果

堿性磷酸酶染色結(jié)果可見大量細(xì)胞染色陽性,胞質(zhì)中出現(xiàn)藍紫色顆粒沉積,確認(rèn)所培養(yǎng)細(xì)胞為成骨細(xì)胞(見圖1)。

注：箭頭所示為成骨細(xì)胞。圖1 成骨細(xì)胞鑒定結(jié)果 (×100)Figure 1 Identification of osteoblast (×100)

2.2 CCK-8細(xì)胞毒性實驗

在同一時間點,0～200 μmol/L的NMDA對成骨細(xì)胞活性的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在一定濃度下,NMDA干預(yù)不同時間對成骨細(xì)胞活性的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖2)。

圖2 NMDA對成骨細(xì)胞活性的影響Figure 2 Effect of NMDA on osteoblast activity

2.3 Ket對成骨細(xì)胞中Runx2及Osterix表達的影響

在同一時間點,與對照組相比,Ket組和Ket+NMDA組Runx2的表達升高(P<0.01);與Ket組相比,Ket+NMDA組Runx2的表達下降(P<0.01,見圖3)。在同一時間點,與對照組相比,Ket組和Ket+NMDA組Osterix的表達升高(P<0.01);同時,與Ket組相比,Ket+NMDA組Osterix的表達下降(P<0.01,見圖4)。

注：與對照組相比,**P<0.01;與Ket組相比,##P<0.01。圖3 Ket對成骨細(xì)胞中Runx2表達水平的影響Figure 3 Effect of Ket on Runx2 expression levels in osteoblasts

2.4 Ket對成骨細(xì)胞中對Bcl-2、Bax以及BDNF蛋白表達的影響

干預(yù)24 h和48 h,與對照組相比,Ket組Bcl-2蛋白的表達量升高(P<0.05);與Ket組相比,Ket+NMDA組Bcl-2蛋白的表達量下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);同時,干預(yù)72 h,對照組、Ket組以及Ket+NMDA組Bcl-2蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

表2 Ket對成骨細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達量的影響 (ng/mL,

干預(yù)24 h和48 h,與對照組相比,Ket組Bax蛋白的表達量下降(P<0.05);與Ket組相比,Ket+NMDA組Bax蛋白的表達量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);同時,干預(yù)72 h,對照組、Ket組以及Ket+NMDA組Bax蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表3)。

表3 Ket對成骨細(xì)胞中Bax蛋白表達量的影響

在同一時間點,與對照組相比,Ket組BDNF蛋白的表達量升高(P<0.05);與Ket組相比,Ket+NMDA組BDNF蛋白的表達量下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表4)。

表4 Ket對成骨細(xì)胞中BDNF蛋白表達量的影響 (ng/mL,

3 討論

N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)不僅表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,還存在于調(diào)節(jié)礦物質(zhì)代謝的3個主要器官(骨骼、甲狀旁腺和腎臟)中,這表明NMDAR在調(diào)節(jié)鈣和磷水平方面也發(fā)揮著重要作用。據(jù)研究報道NMDAR參與了一系列的生理和病理過程,其中包括骨沉積以及傷口愈合[7,8]。眾所周知,成骨細(xì)胞在骨修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用,通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo),可大量增殖、分化,遷移到骨修復(fù)部位,然后經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)分泌骨基質(zhì),引起基質(zhì)礦化,從而達到骨修復(fù)的目的。最近有研究表明在大鼠顱骨成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有NMDAR亞基的mRNA表達,并參與到了體外骨吸收的過程中[9]。然而,NMDAR在骨代謝系統(tǒng)中的確切作用尚不明確,為了研究艾司氯胺酮促進成骨細(xì)胞增殖及分化的機制,本實驗采用艾司氯胺酮和NMDA對體外成骨細(xì)胞進行干預(yù),NMDA是NMDAR的一種特異性激動劑,它只與NMDAR相結(jié)合,而不會影響其他谷氨酸受體[10]。本實驗通過體外實驗發(fā)現(xiàn)艾司氯胺酮可通過拮抗NMDAR促進成骨細(xì)胞的增殖及分化并闡述了其促進作用可能的機制。

Runx2作為調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖分化的最上游轉(zhuǎn)錄因子,可協(xié)同其下游的Osterix促進堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白和骨連接素等蛋白的表達[11,12],刺激成骨細(xì)胞分化成熟,最終加速骨折愈合的過程。在成骨細(xì)胞發(fā)育的過程中,Runx2主要在骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中起作用,Osterix則是成骨細(xì)胞的分化和成熟過程中所必需的[13],在Runx2基因或Osterix基因敲除的小鼠中,其血清中骨形成和骨吸收指標(biāo)均低于對照組,小鼠體內(nèi)完全缺失成骨細(xì)胞[14,15],因此通過測定Runx2及Osterix的相對表達水平可以明確實驗干預(yù)對成骨細(xì)胞增殖及分化的影響。本研究結(jié)果顯示,與對照組相比,Ket組Runx2和Osterix的表達在24,48,72 h均有升高,同時,與Ket組相比,Ket+NMDA組Runx2和Osterix的表達下降,提示艾司氯胺酮可通過拮抗NMDAR促進成骨細(xì)胞的增殖分化。

Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵分子,其蛋白可分為抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1等)和促凋亡蛋白(Bax、Bak等)[16],通過維持這些蛋白之間的平衡,可以確保細(xì)胞的正常增殖分化。增加Bcl-2的表達可以介導(dǎo)細(xì)胞的抗凋亡作用,相反,Bax的表達上調(diào)則可通過調(diào)控線粒體膜的通透性并啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[17,18]。眾所周知,成骨細(xì)胞的增殖分化受到多種因素的影響,延緩成骨細(xì)胞的凋亡對于骨折愈合有著重要的作用。通過檢測不同條件下干預(yù)24,48,72 h后成骨細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達量,我們發(fā)現(xiàn)在24 h和48 h,與Ket組相比,Ket+NMDA組細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達量降低,而Bax蛋白的表達量升高,提示艾司氯胺酮可通過拮抗NMDAR促進抗凋亡基因的表達同時抑制凋亡基因的表達,最終促進成骨細(xì)胞的增殖分化;而在72 h,對照組、Ket組以及Ket+NMDA組Bcl-2和Bax蛋白的表達量沒有明顯差異,這可能意味著艾司氯胺酮只在成骨細(xì)胞分化早期發(fā)揮對Bcl-2及Bax蛋白表達的調(diào)節(jié)作用,隨著時間的推移,相關(guān)蛋白表達已經(jīng)達到穩(wěn)定狀態(tài),因此它們的表達量將不再發(fā)生變化。

BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族,主要在中樞和外周神經(jīng)元組織中發(fā)揮作用。然而,BDNF也可由許多非神經(jīng)元細(xì)胞,例如成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞,合成和釋放。BDNF及其受體存在于骨形成過程的各個階段,并且都參與了成骨細(xì)胞分化的過程[19]。之前的研究發(fā)現(xiàn),艾司氯胺酮可通過拮抗NMDAR增加BDNF的表達進而促進大鼠骨折愈合[20],本實驗通過在細(xì)胞層面檢測不同干預(yù)條件下BDNF的表達情況,結(jié)果顯示,與Ket組相比,Ket+NMDA組細(xì)胞中BDNF蛋白的表達量在各時間點均降低,與前述結(jié)果一致。最近有研究表明,BDNF可促進Bcl-2基因的表達從而發(fā)揮抗凋亡的作用[21,22]。結(jié)合王震等[23]的研究結(jié)果,BDNF能抑制體外成骨細(xì)胞的凋亡,促進成骨細(xì)胞的增殖,由此推測艾司氯胺酮可能通過上調(diào)BDNF的表達對體外成骨細(xì)胞的凋亡起到抑制作用。本實驗亦存在一定的不足之處：首先,本實驗僅通過酶聯(lián)免疫吸附法對相關(guān)蛋白進行檢測,可進一步采用Western blot法評估相關(guān)蛋白的具體表達情況;其次,本實驗僅選取了對成骨細(xì)胞活性無影響的藥物濃度進行干預(yù),未能篩選出促進作用顯著的藥物濃度。因此,在后續(xù)實驗中可考慮擴大樣本量的檢測進一步完善實驗,為艾司氯胺酮的臨床應(yīng)用提供更加充分的參考。

綜上所述,本實驗通過對體外成骨細(xì)胞進行干預(yù),發(fā)現(xiàn)艾司氯胺酮可通過拮抗NMDAR促進成骨細(xì)胞的增殖分化,其機制可能與艾司氯胺酮拮抗NMDAR引起B(yǎng)DNF表達增加,進而促進抗凋亡蛋白的表達同時抑制凋亡蛋白的表達,最終對成骨細(xì)胞的增殖及分化起到促進作用。