鐘里科,米秀芳,舒琦,許高奇,何超能,朱俊峰

(浙江省腫瘤醫(yī)院藥劑科,中國科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所,杭州 310022)

治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring,TDM)是個體化醫(yī)療的重要組成部分,可以幫助患者在正確的時間接受最佳劑量的藥物,提高藥物的有效性和安全性,改善患者的預(yù)后。環(huán)孢素A和他克莫司是臨床上應(yīng)用最廣泛的2種免疫抑制劑,常用于治療移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病[1-2]。然而,這2種藥物的治療窗狹窄,藥動學(xué)個體差異大,因此用藥期間需要進(jìn)行TDM[3-4]。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectormetry,HPLC-MS/MS)法是一種強(qiáng)大的分析技術(shù),已被廣泛用于生物樣品等復(fù)雜基質(zhì)中藥物的定量測定。HPLC-MS/MS具有高選擇性、高靈敏度和高精確度的特點(diǎn),已成為環(huán)孢素A和他克莫司TDM的理想方法[5],其準(zhǔn)確性和精確度受到幾個因素的影響,包括基質(zhì)效應(yīng)、離子抑制和校準(zhǔn)曲線擬合等。因此,有必要建立和評估室內(nèi)質(zhì)量控制系統(tǒng)以確保方法的可靠性和重復(fù)性。

本研究旨在利用HPLC-MS/MS建立一種快速、可靠的環(huán)孢素A和他克莫司TDM方法,并應(yīng)用Westgard 多規(guī)則質(zhì)控體系對2022年第3季度環(huán)孢素A和他克莫司TDM過程中的隨行質(zhì)控樣品測定值進(jìn)行Levery-Jennings和Z分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖分析,以期完善環(huán)孢素A和他克莫司治療藥物監(jiān)測的室內(nèi)質(zhì)量控制體系,提高血藥濃度監(jiān)測的準(zhǔn)確性,為臨床提供參考。

1 儀器與試劑

1.1儀器 AB SCIEX Triple Quad 4500MD液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司);HERAEUS MULTIFUGE 3SR+低溫離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司);BS124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,感量:0.1 mg);DMT-2500多管漩渦混合儀(杭州米歐儀器有限公司);CASCADA I超純水制備儀(美國 PALL 公司)。

1.2試劑 環(huán)孢素A對照品(批號:GC113281,含量>98%),他克莫司對照品(批號:GC162331,含量>98%),環(huán)孢素D(作為環(huán)孢素A的內(nèi)標(biāo))對照品(批號:GC118661,含量>98%),子囊霉素(作為他克莫司的內(nèi)標(biāo))對照品(批號:GC132151,含量>98%),均購自美國GlpBio公司。甲酸和乙酸銨均為色譜純,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇和乙腈均為色譜純,購自德國Merck公司。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1儲備液的配制 分別精密稱取環(huán)孢素A 10.4 mg和他克莫司9.9 mg于不同10 mL量瓶,用甲醇溶解并定容,制得1.04 mg·mL-1的環(huán)孢素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液和0.99 mg·mL-1的他克莫司標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1份;同法分別制備1.10 mg·mL-1的環(huán)孢素A質(zhì)控儲備液和0.99 mg·mL-1的他克莫司質(zhì)控儲備液各1份;同法分別制備1.00 mg·mL-1的環(huán)孢素D內(nèi)標(biāo)儲備液和0.95 mg·mL-1的子囊霉素內(nèi)標(biāo)儲備液各1份。儲備液于-30 ℃保存。

2.1.2工作液的配制 精密吸取環(huán)孢素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL和他克莫司標(biāo)準(zhǔn)儲備液5 μL于同一個10 mL量瓶,用50%甲醇稀釋至刻度,制得環(huán)孢素A和他克莫司濃度分別為10 400.00和495.00 ng·mL-1的混標(biāo)工作液;同法用質(zhì)控儲備液制得環(huán)孢素A和他克莫司濃度分別為8 800.00和396.00 ng·mL-1的質(zhì)控工作液;同法用內(nèi)標(biāo)儲備液制得環(huán)孢素D和子囊霉素濃度分別為500.00和49.50 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.1.3校正樣品及質(zhì)控樣品的制備 將人空白全血與混標(biāo)工作液按9：1混合,制得環(huán)孢素A和他克莫司濃度分別為1 040.00和49.50 ng·mL-1的定量上限樣品,之后用空白全血逐級稀釋,制得一系列濃度梯度的校正樣品,其中環(huán)孢素A的濃度梯度為:10.40、20.80、52.00、104.00、08.00、20.00、1 040.00 ng·mL-1,他克莫司的濃度梯度為:0.50、0.99、2.48、4.95、9.90、24.75、49.50 ng·mL-1。同法用質(zhì)控工作液制得3個濃度水平的質(zhì)控樣品,其中環(huán)孢素A的濃度為17.60、88.00、880.00 ng·mL-1,他克莫司的濃度為0.79、3.96、39.60 ng·mL-1。

2.2樣品前處理 精密吸取全血100 μL于1.5 mL EP管,加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μL混勻,然后加入濃度為100 mmol·L-1的硫酸鋅溶液100 μL,2 500 r·min-1渦旋3 min,靜置5 min。之后加入乙腈300 μL沉淀蛋白,2 500 r·min-1渦旋3 min后以15 000 r·min-1離心10 min。離心后取上清液進(jìn)樣分析。

2.3色譜條件 色譜柱為WatersXbridge C18(2.1 mm×50 mm,3.5 μm);流動相為2 mmol·L-1乙酸銨-0.1%甲酸溶液(A):2 mmol·L-1乙酸銨-0.1%甲酸甲醇溶液(B),梯度洗脫:0—0.2min,10% B;0.2—0.7min,10%→100% B;0.7—2.0min,100% B;2.0—2.25min,100%→10% B;2.25—3.5 min,10% B;分析時間3.5 min;流速0.5 mL·min-1;柱溫60 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

2.4質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)離子源,正離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring mode,MRM)掃描。優(yōu)化后的離子源參數(shù):氣簾氣為35 psi,離子化電壓為5 500 V,溫度(temperature,TEM)為450 ℃,噴霧氣為40 psi,輔助加熱氣為40 psi,碰撞氣為7 psi。各化合物的子離子掃描圖見圖1,優(yōu)化后的MRM參數(shù)見表1。

圖1 環(huán)孢素A(A)、環(huán)孢素D(B)、他克莫司(C)及子囊霉素(D)的離子掃描圖

表1 優(yōu)化后的化合物MRM參數(shù)

2.5方法學(xué)評價

2.5.1專屬性 在上述條件下,環(huán)孢素A及其內(nèi)標(biāo)環(huán)孢素D的保留時間分別為1.49和1.50 min,他克莫司及其內(nèi)標(biāo)子囊霉素的保留時間均為1.44 min。同時,定量下限樣品中待測物的響應(yīng)值為空白全血的10倍以上,全血中的內(nèi)源性成分對待測物及內(nèi)標(biāo)無干擾,表明本方法專屬性良好,見圖2。

圖2 環(huán)孢素A、他克莫司、環(huán)孢素D和子囊霉素在空白全血(A)、零點(diǎn)樣品(B)及定量下限樣品(C)中的色譜圖

2.5.2線性及定量下限 環(huán)孢素A在10.40～1 040.00 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性方程為Y=0.019 63X+0.029 62(r=0.999 3);他克莫司在0.50～49.50 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性方程為Y=0.190 64X+0.066 03(r=0.999 5)。環(huán)孢素A及他克莫司的定量下限分別為10.40和0.50 ng·mL-1,其定量下限的準(zhǔn)確度及精密度見表2。偏差(Bias,%)及變異系數(shù)(CV,%)均<20.0%,滿足生物樣品定量分析要求。

表2 環(huán)孢素A及他克莫司的日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度和精密度

2.5.3準(zhǔn)確度和精密度 不同濃度環(huán)孢素A及他克莫司的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度Bias均在±15.0%以內(nèi),精密度CV≤15.0%,滿足生物樣品定量分析要求,見表2。

2.5.4提取回收率 不同濃度環(huán)孢素A的提取回收率為108.61%～113.24%,他克莫司的提取回收率為101.99%～109.37%,見表3。

表3 環(huán)孢素A及他克莫司的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

2.5.5基質(zhì)效應(yīng) 不同濃度環(huán)孢素A的基質(zhì)因子(matrix factors,MF)為70.46%～71.86%,其內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子為106.68%～111.27%;他克莫司的基質(zhì)因子為99.80%～106.55%,其內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子為95.70%～97.81%,均符合生物樣本定量分析要求,見表3。

2.5.6穩(wěn)定性實驗 不同濃度環(huán)孢素A及他克莫司在室溫不避光放置6 h、在4 ℃放置3 d、在處理后放置于自動進(jìn)樣器24 h的Bias為-1.62%～14.40%,CV為1.41%～9.05%,表明環(huán)孢素A及他克莫司在相應(yīng)條件下基本穩(wěn)定。

2.5.7進(jìn)樣殘留 在連續(xù)進(jìn)樣2針定量上限樣品后的空白樣品中未檢測到待測物和內(nèi)標(biāo)的殘留。

2.5.8稀釋倍數(shù) 為了應(yīng)對臨床上可能遇到的極高濃度樣品,本研究將10倍定量上限樣品用空白全血稀釋10倍后分析,環(huán)孢素A的準(zhǔn)確度Bias為-1.30%,精密度CV為3.30%;他克莫司的準(zhǔn)確度Bias為7.85%,精密度CV為2.53%,表明在相關(guān)范圍內(nèi)可采用空白全血稀釋高濃度樣品后進(jìn)行測定。

2.6Westgard多規(guī)則質(zhì)量控制評價

A:低濃度環(huán)孢素A;B:中濃度環(huán)孢素A;C:高濃度環(huán)孢素A;D:低濃度他克莫司;E:中濃度他克莫司;F:他克莫司高濃度。

A:環(huán)孢素A;B:他克莫司。

2.7方法應(yīng)用 采用建立的血藥濃度檢測方法測定臨床樣本中的環(huán)孢素A和他克莫司濃度。2022年第三季度共有33個環(huán)孢素A血樣送檢,測定值為(206.18±189.28) ng·mL-1;8個他克莫司血樣送檢,測定值為(6.12±5.67) ng·mL-1。結(jié)果表明,患者體內(nèi)的環(huán)孢素A和他克莫司谷濃度個體間差異很大,見圖5。結(jié)合隨行質(zhì)控與Westgard 多規(guī)則理論評價,本時間段環(huán)孢素A和他克莫司血藥濃度檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠,可以有效幫助醫(yī)生調(diào)整臨床給藥劑量。

圖5 環(huán)孢素A和他克莫司的谷濃度

3 討論

環(huán)孢素A和他克莫司均為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑,能夠通過抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生,減少淋巴細(xì)胞增殖,發(fā)揮免疫抑制作用。其在血液中的分布較為復(fù)雜,大部分分布于紅細(xì)胞,因此往往以全血藥物濃度作為反映其藥效或毒性的藥動學(xué)指標(biāo)[6]。環(huán)孢素A和他克莫司的治療窗分別為150～350和5～20 ng·mL-1,因此在全血中所需的檢測限度要求分別為20和1 ng·mL-1[7]。目前,國內(nèi)多采用免疫法檢測人全血中的環(huán)孢素A和他克莫司濃度,但免疫法的選擇性不佳,可能存在代謝物干擾,且所需的試劑盒價格昂貴,并無法同時檢測多種免疫抑制劑。LC-MS/MS法作為治療藥物監(jiān)測的金標(biāo)準(zhǔn),專屬性好,靈敏度高,能夠同時檢測多種藥物[8]?；诖?本文通過HPLC-MS/MS技術(shù)建立了一種快速、可靠的環(huán)孢素A和他克莫司全血藥物濃度檢測方法。方法學(xué)驗證按照FDA制定的生物分析方法驗證指南進(jìn)行[9-11],將簡單的細(xì)胞裂解+蛋白沉淀作為樣品前處理方法,分析時間僅為3.5 min,環(huán)孢素A及他克莫司的定量下限分別為10.40和0.50 ng·mL-1,能夠很好地滿足臨床治療藥物監(jiān)測需求。

在TDM中,質(zhì)量控制有助于檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化和可靠性,促進(jìn)患者用藥安全,因此,室內(nèi)質(zhì)量控制評估對TDM具有重要意義[12]。目前,在同時檢測環(huán)孢素A和他克莫司血藥濃度的TDM方法中,大部分是基于免疫分析法的室內(nèi)質(zhì)控研究[13],尚無LC-MS/MS檢測方法的室內(nèi)質(zhì)控研究報道。本研究中,筆者聯(lián)合Levery-Jennings質(zhì)控圖和Z分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖,應(yīng)用Westgard 多規(guī)則理論進(jìn)行質(zhì)控評價,對LC-MS/MS 測定環(huán)孢素A和他克莫司血藥濃度的室內(nèi)質(zhì)量控制進(jìn)行深入的探索。Levery-Jennings質(zhì)控圖通過將1倍、2倍和3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為控制線、警戒線和失控線,可以提高實驗的精度和準(zhǔn)確性,但只適用于同一水平的質(zhì)量控制,不適用于不同階段或不同體積的樣品質(zhì)量控制[14]。Z分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖可以將不同水平的質(zhì)控樣品測定值轉(zhuǎn)換成同一標(biāo)準(zhǔn),使其可以在同一張圖上直觀地顯示比較結(jié)果[15]。該2種方法雖然操作簡便,但僅對隨機(jī)誤差敏感,無法十分準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差。置換Westgard多規(guī)則是第2代質(zhì)量控制方法,通過設(shè)定12S/13S/22S/R4S/41S/10X 規(guī)則,結(jié)合Levey-Jennings質(zhì)控圖來判斷測定結(jié)果是否可控,不僅可敏銳地發(fā)現(xiàn)隨機(jī)誤差,還能夠準(zhǔn)確地判斷系統(tǒng)誤差,顯著提高誤差檢出能力[16-17]。與僅僅依靠隨行質(zhì)控判斷是否處于控制狀態(tài)的“即刻法”不同,使用Westgard多規(guī)則理論進(jìn)行血藥濃度質(zhì)量控制更加精確和有效,該方法不僅可以幫助檢測出異常的數(shù)據(jù),還可以通過指定多個規(guī)則來維護(hù)穩(wěn)定的分析表現(xiàn),已被廣泛應(yīng)用于藥物治療監(jiān)測領(lǐng)域,并取得了不錯的效果,因此受到越來越多的關(guān)注和認(rèn)可[15-17]。筆者在本研究中利用該方法對2022年第三季度期間環(huán)孢素A和他克莫司的血藥濃度監(jiān)測進(jìn)行質(zhì)量評估,發(fā)現(xiàn)警告4次(違反12s規(guī)則),其余樣品均在控,提示建立的LC-MS/MS在環(huán)孢素A和他克莫司血藥濃度的長期檢測中具有較好的穩(wěn)定性。

綜上所述,本研究利用LC-MS/MS 技術(shù)建立一種靈敏、快速、可靠的環(huán)孢素A和他克莫司血藥濃度檢測方法。通過完善室內(nèi)質(zhì)控評估體系,可以從根本上提高環(huán)孢素A和他克莫司血藥濃度檢測的精準(zhǔn)度和綜合質(zhì)量,確?；颊叩闹委熜Ч团R床安全。同時,該質(zhì)控評估體系也可以為臨床實踐提供科學(xué)可靠的指導(dǎo),為醫(yī)療工作者的臨床決策提供支持。