張 韞,李 婷,劉炫驛,邊雯倩

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,陜西 西安 710021)

癌癥是世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題之一,已成為導(dǎo)致人類死亡的主要原因。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)于2021年發(fā)布的《全球癌癥報告》統(tǒng)計顯示,2020年在世界范圍內(nèi)約有1 930萬癌癥的新發(fā)病例和1 000萬癌癥死亡病例[1]。目前,臨床治療腫瘤的方法有手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療和免疫治療等?；瘜W(xué)藥物治療簡稱化療,這種全身性的治療手段對原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和亞臨床轉(zhuǎn)移灶均有療效,具有廣譜性,因此被廣泛應(yīng)用于多種癌癥的輔助治療、新輔助治療及晚期的治療。近年來,研究人員已經(jīng)開發(fā)了多種用于腫瘤治療的化療藥物,但因存在不可控釋放、非靶向遞送、毒副作用大等問題限制了其臨床應(yīng)用[2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的不斷深入,一些中藥及其活性成分因具有良好的抗腫瘤活性和較小的毒副作用受到研究人員的廣泛關(guān)注,是目前化療藥物開發(fā)的重要來源之一[3]。姜黃素(curcumin,CUR)是從天南星科、姜科植物的根莖中提取的一種二酮類化合物,廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域[4]。研究發(fā)現(xiàn),CUR可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt、TGF-β/Smad2/3、Wnt/β-catenin、JAK/STAT、p53、p38、MAPKs、NF-κB等多種信號通路來抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)自噬、增加活性氧(ROS)產(chǎn)生及減輕炎癥反應(yīng)等,對宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌等癌癥均有一定的治療效果[5],且CUR能夠一定程度降低藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高表達(dá)導(dǎo)致的腫瘤耐藥性[6]。盡管CUR具有獨特的抗腫瘤活性,但因其代謝迅速、口服生物利用度差、水溶性和化學(xué)穩(wěn)定性差、細(xì)胞攝取不足、首過效應(yīng)強(qiáng)、口服吸收差等缺點限制了其臨床應(yīng)用[7]。為了克服上述問題,研究人員提出開發(fā)CUR納米遞藥系統(tǒng)來改善CUR的理化性質(zhì),提升其抗腫瘤效果[8]。

1958年,Albert提出“前藥”的概念,是指將藥物分子通過修飾連接到載體上,得到在生物體外無活性、在體內(nèi)經(jīng)各種轉(zhuǎn)化能重新釋放出活性藥物分子的化合物,具有增強(qiáng)疏水性藥物的溶解性和穩(wěn)定性,提高藥物生物利用度、延長體內(nèi)循環(huán)時間、提高藥物負(fù)載率、降低藥物毒副作用、調(diào)控組織滲透和藥物釋放等優(yōu)勢[9],已成為藥學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)與生命科學(xué)及其交叉學(xué)科的研究熱點。常用的載體有前藥脂質(zhì)體[10]、膠束[11-12]、凝膠[13-14]等。與傳統(tǒng)的物理包埋相比,化學(xué)鍵合聚合物前藥是將藥物分子以刺激響應(yīng)性共價化學(xué)鍵(如酯鍵、腙鍵、酰胺鍵、二硫鍵、硫醚等)[15]鍵合到聚合物支鏈或?qū)误w與藥物直接共聚制成,有效改善了傳統(tǒng)納米遞藥系統(tǒng)存在的載藥率低及血液循環(huán)泄露等問題,并能進(jìn)一步調(diào)控藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的釋放行為。具有適宜尺寸的納米粒子可通過實體瘤的高通透性和滯留(enhanced permeability and retention,EPR)效應(yīng)富集在腫瘤部位實現(xiàn)被動靶向[16],但僅通過EPR效應(yīng)進(jìn)行被動靶向并沒有達(dá)到理想的抗腫瘤效果,因此,開發(fā)更加“智能”化的納米遞藥系統(tǒng)對實現(xiàn)腫瘤的高效治療具有重要意義。刺激響應(yīng)性納米遞藥系統(tǒng)可以利用內(nèi)部或外部刺激因素,如pH值、溫度、特異性酶、氧化還原、光和磁場等來提高納米遞藥系統(tǒng)的靶向性[17]。基于pH的響應(yīng)是常用的刺激響應(yīng)類型,當(dāng)?shù)竭_(dá)腫瘤細(xì)胞時,pH響應(yīng)性聚合物前藥會對腫瘤細(xì)胞內(nèi)溶酶體的酸性環(huán)境產(chǎn)生響應(yīng)并高效釋放藥物達(dá)到治療效果[18]。

自2001年Sharpless等提出點擊化學(xué)(click chemistry)后,這一概念被廣泛應(yīng)用于有機(jī)和高分子合成領(lǐng)域。利用簡單、高效、快速的點擊反應(yīng)可以構(gòu)建各種復(fù)雜結(jié)構(gòu)的納米材料、遞藥載體等。Song等[19]基于氨基-炔基的點擊化學(xué)反應(yīng)制備了一系列酸敏感性聚合物前藥。將合成醛改性的不同分子量的聚乙二醇(PEG)與阿霉素(DOX)氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng),制備了不同分子量的聚乙二醇前藥DOX-PEG-DOX。這種兩親性聚合物前藥可以在水溶液中自組裝成納米粒子,在酸性條件下發(fā)生酸響應(yīng)性基團(tuán)斷裂,實現(xiàn)DOX在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的遞送。

作者基于點擊化學(xué)反應(yīng),將己烷-1,6-二丙炔酸二酯與原本無法參與聚合反應(yīng)的酚羥基藥物CUR直接交聯(lián)在聚合物主鏈上,得到主鏈型聚合物前藥,以實現(xiàn)藥物在腫瘤部位的“智能”化控制釋放,為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供新策略。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

姜黃素(CUR,97%)、1,6-己二醇(98%)、丙炔酸(95%)、氘代氯仿(99.8%)、對甲苯磺酸(98%)、溴化鉀(光譜純),上海阿拉丁試劑有限公司;乙腈、碳酸氫銨、三氯甲烷、乙酸乙酯,分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;無水硫酸鎂、碳酸氫銨等,分析純,上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司;實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

UV-2600型紫外可見分光光度計,日本島津儀器有限公司;FluoroMax-4p型穩(wěn)態(tài)及瞬態(tài)熒光光譜儀,法國Horiba公司;Gemini360型掃描電子顯微鏡,德國Zeiss公司;ZS90型納米粒度電位儀,英國馬爾文儀器有限公司;400 Plus型核磁共振波譜儀、Tensor27型紅外光譜儀,德國布魯克公司;BSA224-CW型電子天平,德國賽多利斯有限公司;SB-5200DT/200W型超聲波清洗器,寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 聚合物前藥的合成

1.2.1 己烷-1,6-二丙炔酸二酯的合成(圖1)

圖1 己烷-1,6-二丙炔酸二酯的合成路線Fig.1 Synthetic route of hexane-1,6-diyl dipropiolate

分別精密稱取11.8 g 1,6-己二醇、28.0 g丙炔酸和1.0 g對甲苯磺酸,量取300 mL無水甲苯,加入裝有水分離器和冷凝器的三頸瓶中,140 ℃回流約96 h。冷卻后,有機(jī)相用飽和NaHCO3溶液和蒸餾水洗滌,分離有機(jī)相,用無水MgSO4干燥,過濾,旋蒸除去溶劑,真空干燥后靜置固化,析出產(chǎn)物己烷-1,6-二丙炔酸二酯[20]。

取適量己烷-1,6-二丙炔酸二酯于核磁管中,用氘代氯仿(CDCl3)溶解,采用核磁共振波譜儀測定該物質(zhì)中氫原子的化學(xué)位移。

1.2.2 聚合物前藥的合成

分別精密稱取3.4 mg己烷-1,6-二丙炔酸二酯溶于0.2 mL乙腈、3.8 mg CUR溶于0.8 mL乙腈、10.0 mg NaHCO3溶于10 mL超純水;再量取20 mL 30%乙醇溶液于60 mL圓底燒瓶中,依次加入己烷-1,6-二丙炔酸二酯溶液、NaHCO3溶液和CUR溶液,水浴加熱至40 ℃,200 W超聲避光反應(yīng)30 min至體系渾濁后,11 000 r·min-1離心12 min,棄去上清液,得聚合物前藥(BC);分別用無水乙醇洗滌1次、超純水洗滌3次,使聚合物前藥均勻分散于超純水中,即得聚合物前藥納米混懸劑,避光保存。

1.3 聚合物前藥的結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 紫外可見吸收光譜

使用紫外可見分光光度計在200～700 nm范圍內(nèi)對聚合物前藥納米混懸劑進(jìn)行紫外可見吸收光譜掃描。

1.3.2 熒光光譜

使用熒光光譜儀對聚合物前藥納米混懸劑的熒光光譜進(jìn)行定性分析。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm;激發(fā)光柵1 200 gr·mm-1,閃耀角330 nm;發(fā)射光柵1 200 gr·mm-1,閃耀角500 nm;激發(fā)光λex=430 nm,于500～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行熒光光譜掃描。

1.3.3 紅外光譜

采用紅外光譜儀對官能團(tuán)進(jìn)行表征判定分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。取一定量的聚合物前藥納米混懸劑加入離心管中,高速離心后棄去上清液;再加入無水乙醇,重復(fù)上述操作;然后置于35 ℃真空干燥箱中干燥。將干燥產(chǎn)物和溴化鉀(光譜純)混合,研磨成粉末,壓片,使用紅外光譜儀在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描,分辨率4 cm-1。

1.4 聚合物前藥的形貌表征

1.4.1 粒徑分布

取聚合物前藥納米混懸劑少許,加超純水稀釋至適宜濃度,超聲使其分散均勻,采用激光粒度儀,散射角90°,在25 ℃下以水為分散介質(zhì)測定粒徑分布和多分散系數(shù)(PDI)。

1.4.2 掃描電鏡照片

取聚合物前藥納米混懸劑少許,超聲將樣品分散均勻后滴于硅片上,自然干燥后,使用掃描電子顯微鏡對樣品的粒徑、形貌進(jìn)行分析。測試工作參數(shù)如下：InLens模式,加速電壓(EHT)10.0 kV,工作距離(WD)7.9 mm,孔徑30.0 μm。

2 結(jié)果與討論

2.1 己烷-1,6-二丙炔酸二酯的1HNMR表征

1HNMR(CDCl3),δ：4.21(t,2H),2.91(s,1H),1.71(m,2H),1.42(m,2H)。其中δ4.21為與酯鍵相連的2個亞甲基的質(zhì)子峰,δ1.71為與之相鄰的2個亞甲基的質(zhì)子峰,δ1.42為中間2個亞甲基的質(zhì)子峰,δ2.91為2個炔基的質(zhì)子峰。

2.2 聚合物前藥的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紫外可見吸收光譜分析(圖2)

圖2 聚合物前藥和CUR的紫外可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of polymeric prodrug and CUR

由圖2可知,CUR及聚合物前藥的最大吸收波長分別為431 nm和475 nm,由于己烷-1,6-二丙炔酸二酯本身沒有紫外吸收,與CUR鍵合生成聚合物前藥后,CUR的特征吸收峰紅移約44 nm。故推斷己烷-1,6-二丙炔酸二酯與CUR發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)。

2.2.2 熒光光譜分析(圖3)

圖3 聚合物前藥和CUR的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of polymeric prodrug and CUR

由圖3可知,當(dāng)激發(fā)光為430 nm時,CUR、聚合物前藥的最大熒光發(fā)射波長分別為554 nm、561 nm,CUR的最大熒光發(fā)射波長紅移約7 nm。故進(jìn)一步推斷己烷-1,6-二丙炔酸二酯與CUR發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)。

2.2.3 紅外光譜分析(圖4)

圖4 聚合物前藥、CUR及己烷-1,6-二丙炔酸二酯的紅外光譜Fig.4 FTIR spectra of polymeric prodrug,CUR,and hexane-1,6-diyl dipropiolate

由圖4可知,己烷-1,6-二丙炔酸二酯的紅外光譜中,2 111 cm-1和3 226 cm-1處特征峰歸屬于炔基碳及炔基氫的伸縮振動;1 699 cm-1處為碳氧伸縮振動特征峰,上述特征峰符合己烷-1,6-二丙炔酸二酯的結(jié)構(gòu)。聚合物前藥的紅外光譜中,在3 128 cm-1處有一個明顯的寬峰,主要是由空間位阻影響未發(fā)生點擊反應(yīng)的酚羥基和自身不能發(fā)生點擊反應(yīng)的醇羥基伸縮振動產(chǎn)生;2 111 cm-1處炔基碳的特征峰消失,說明己烷-1,6-二丙炔酸二酯的端炔基與CUR發(fā)生了點擊反應(yīng);1 627 cm-1、1 508 cm-1、1 282 cm-1、1 128 cm-1等處的特征峰與CUR中的1 625 cm-1、1 510 cm-1、1 278 cm-1、1 151 cm-1等處的吸收峰非常接近且峰形相近,說明聚合物前藥分子結(jié)構(gòu)中具有多個與CUR相同的官能團(tuán)。因此可以推斷,CUR與己烷-1,6-二丙炔酸二酯發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成了聚合物前藥。

2.3 聚合物前藥的形貌表征

粒徑是抗腫瘤納米藥物的重要指標(biāo),粒徑符合條件的納米粒子基于EPR 效應(yīng)在腫瘤組織內(nèi)部積累,從而發(fā)揮藥效。PDI是評價納米粒子粒徑分布均勻程度的重要指標(biāo),在動態(tài)光散射下測定聚合物前藥的水合直徑和PDI,用掃描電鏡觀察聚合物前藥納米粒子的表面形貌,結(jié)果如圖5所示。

圖5 聚合物前藥的粒徑分布及掃描電鏡照片F(xiàn)ig.5 Particle size distribution and SEM image of polymeric prodrug

由圖5可知,在動態(tài)光散射下測得聚合物前藥的水合直徑為231.5 nm,PDI為0.180;聚合物前藥表面光滑、輪廓清晰,呈粒徑為100～200 nm的均勻球形納米粒子,分散性較好,無明顯的孔洞和塌陷,聚集現(xiàn)象不明顯。因水合直徑包含了所測粒子表面結(jié)合的溶劑層或與粒子一起運(yùn)動的其它分子,故大于掃描電鏡所測的粒徑結(jié)果。聚合物前藥的粒徑處于最適合發(fā)揮腫瘤EPR效應(yīng)的粒徑范圍,符合被動靶向的粒徑要求。

Zeta 電位是衡量納米遞藥系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要參數(shù),相對較高的電位可以使納米顆粒間的斥力增大,并增加納米粒子在溶液體系的穩(wěn)定性,從而避免團(tuán)聚或沉淀現(xiàn)象的發(fā)生。聚合物前藥納米粒子的平均Zeta電位為-33.5 mV,說明該納米體系較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

基于點擊化學(xué)反應(yīng),簡便、快速、高效地設(shè)計合成了具有腫瘤微環(huán)境酸響應(yīng)性的主鏈型納米聚合物前藥。利用可控制備技術(shù),將己烷-1,6-二丙炔酸二酯與姜黃素直接交聯(lián)后通過共價鍵連接到聚合物骨架,有利于提高載藥率和穩(wěn)定性。通過改變給藥方式更易富集在病灶部位,實現(xiàn)被動靶向,在一定程度上為解決傳統(tǒng)藥物特異性差、毒副作用大、血液循環(huán)時間短等問題提供了新思路,為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供了新策略。