肖繼平,高 暢,龐 振,金英海
(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133000)
仔豬早期一般在產(chǎn)后15~28 d進(jìn)行斷奶,斷奶時機對仔豬的發(fā)育有很大影響,斷奶過早會因環(huán)境因素和飼料組成的突然變化干擾仔豬的消化和代謝功能,從而使仔豬患腹瀉等疾病的風(fēng)險增加[1-2]。對于仔豬斷奶而產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng),通常都會使用抗生素進(jìn)行治療,但在實際生產(chǎn)中大量應(yīng)用抗生素會使細(xì)菌的耐藥性增強,從而導(dǎo)致仔豬抗病能力下降,并且還可能伴隨藥物殘留等諸多問題[3]。2019年,國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部宣布,為有效預(yù)防疾病,抗生素一類的添加劑被嚴(yán)格禁止在養(yǎng)殖過程中應(yīng)用,而飼料添加劑的研究熱門也轉(zhuǎn)向了研制無毒無害、安全綠色的替抗添加劑產(chǎn)品。中草藥是我國自古以來一直作為天然藥物使用的一類草本植物,中草藥中所蘊含的生物堿、揮發(fā)油類、有機酸類、多糖類以及單寧等物質(zhì)會經(jīng)由動物的采食在動物機體的腸道內(nèi)發(fā)揮作用,能有效控制有害菌的繁殖,使動物的免疫力得到增強[4]。研究表明,采用微生態(tài)制劑可以顯著提升動物體內(nèi)免疫球蛋白和其他免疫活性因子的水平,從而有效增強機體免疫力,確保動物的健康生長[5],崔瑩[6]以酵母菌和枯草桿菌培養(yǎng)物飼喂肉羊,顯著提高肉羊的免疫功能和抗應(yīng)激能力。李薛強等[7]以酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢桿菌的復(fù)合培養(yǎng)物飼喂母豬,可提高母豬免疫力和抗氧化能力,顯著提高IgG、IgM及GSH-PX的活力。中草藥中含有很多成分需要經(jīng)過腸道菌群水解或還原等分解代謝后發(fā)揮出強大的藥理作用,這類活性物質(zhì)在沒有微生物作用的情況下藥理活性很低,因此在一些研究中,中草藥與益生菌聯(lián)合使用能起到極佳的協(xié)同效果[8]。
該試驗通過在斷奶仔豬飼料中分別添加3菌培養(yǎng)物、中藥制劑以及3菌培養(yǎng)物中藥合劑,檢測了不同飼料添加劑對斷奶仔豬抗氧化、抗應(yīng)激能力和機體免疫力的相關(guān)指標(biāo),同時探究了2種添加劑聯(lián)用的效果是否優(yōu)于分別單一使用其中一種添加劑的效果。為研發(fā)新型無抗飼料添加劑的開發(fā)和應(yīng)用提供有效論證。
3菌培養(yǎng)物(延邊大學(xué)營養(yǎng)實驗室自制,由乳酸菌、酵母菌及枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)制成)、中藥制劑(中草藥通過粉碎處理,再經(jīng)40目進(jìn)行2次處理),均出自亳州眾益堂有限公司;3菌中藥合劑由中藥制劑與3菌培養(yǎng)物混合而成(1∶1混合),所有飼料添加劑即配即用。
從35日齡的健康、沒有疾病的三元雜交(杜×長×白)斷奶仔豬中抽取80頭,保證仔豬性別比例一致并將試驗樣本以隨機分組原則為基礎(chǔ)將其分為4組,每組按每個重復(fù)數(shù)5頭設(shè)定為4個重復(fù)。采用該方法分組后,以基礎(chǔ)日糧飼喂對照組,基礎(chǔ)日糧添加0.5% 3菌培養(yǎng)物飼養(yǎng)A組,基礎(chǔ)日糧添加0.5%中藥制劑飼養(yǎng)B組,加入0.5% 3菌中藥合劑(2種物質(zhì)1∶1混合)的基礎(chǔ)日糧飼喂C組。試驗期為47 d(預(yù)試期:5 d;試驗期:42 d),試驗場所由圖們市富巖養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。
斷奶仔豬的階段性飼料更換依據(jù)養(yǎng)殖場的常規(guī)更換原則,分別在1、15、29 d時進(jìn)行。各組仔豬日糧均為粉狀,具體組成及營養(yǎng)水平見表1,2。
表1 仔豬各階段基礎(chǔ)日糧組成
表2 各階段基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)成分含量
1.4.1 血樣采集
待飼養(yǎng)試驗完結(jié)后,隨機從各組仔豬中挑選4頭(挑選出的個體體重均為所處重復(fù)最接近平均水平的1頭),在清晨飼喂前用頸下采血的方式用采血器進(jìn)行操作,操作完成后常溫下對樣本做靜置15 min的處理,靜置處理過后再離心15 min(3 000 r/min),取上清-80 ℃保存,以備后續(xù)使用。
1.4.2 血液生化指標(biāo)測定
根據(jù)對總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和丙二醛等血清抗氧化酶活力的檢測,可以更好地了解機體的氧化應(yīng)激能力。
測定皮質(zhì)醇(COR)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ATCH)、肌酸激酶(CK)的濃度來反映血清應(yīng)激激素相關(guān)指標(biāo)。
測定血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)含量表現(xiàn)血清免疫指標(biāo)。
檢測血清中3種酶(谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及堿性磷酸酶)的活性和球蛋白、白蛋白、尿素、膽固醇和甘油三酯的水平共同反映機體血清生物學(xué)指標(biāo)。
所有試驗材料的指標(biāo)檢測工作都由北京華英生物技術(shù)研究所提供。
通過使用Excel和SPSS 23.0統(tǒng)計軟件,將所得數(shù)據(jù)通過ANOVA與LSD法來分析及多重比較,“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示試驗結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)的變化情況如下:當(dāng)P<0.05時,說明有顯著性差異,當(dāng)P<0.01時,說明有極顯著差異。
血清樣本通過試劑盒檢測抗氧化相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果顯示(表3),相對于對照組,各試驗組的飼料添加劑均能增強斷奶仔豬的抗氧化水平。所有試驗組相較于對照組而言,SOD活性均有不同程度的提高,A組為顯著(P<0.05),B組與C組為極顯著(P<0.01),試驗組相比之下不難發(fā)現(xiàn),C組最優(yōu)且明顯強于A組(P<0.05),但與B組相差不大;T-AOC的結(jié)果顯示,對照組極顯著弱于各個試驗組(P<0.01),GSH-Px的結(jié)果亦是如此,但兩物質(zhì)活性在組間相比,試驗A和B組雖然差異不顯著(P>0.05),但都顯著或極顯著弱于C組(A組P<0.01;B組P<0.05));從CAT的活性來看,對照組與各試驗組差異極大,組間比較可以看出,B組和C組雖然差異不大(P>0.05),但都強于A組(P<0.05);而從MDA含量來講,雖然試驗組間差異不大(P>0.05),但與對照組相比,B組和C組都顯示出顯著下降的結(jié)果(P<0.05),但A組有下降趨勢。
表3 各組對斷奶仔豬血清抗氧化能力的影響
通過表4數(shù)據(jù)對比可知,C組試驗組斷奶仔豬的抗應(yīng)激能力與對照組相比均有提升。在對試驗群體的結(jié)果進(jìn)行了研究之后,發(fā)現(xiàn)它們的COR和CK值明顯低于對比群體(P<0.01),而且COR的差別更為突出。C組與其余2個試驗組之間的差別極其顯著(P<0.01),并且B組優(yōu)于A組(P<0.05)。然而,試驗組之間的CK值差異并不明顯。然而,ATCH值的差異卻十分鮮明,A組與對照組之間的差異最為明顯(P<0.01),而與B組和C組的差異則顯著(P<0.05)。所有這些發(fā)現(xiàn)都指出,試驗組之間存在著很大的差異。經(jīng)過組間比較,結(jié)果表明,A組與B組之間的差異極顯著(P<0.01),而B組與C組之間的差異顯著(P<0.05)。
表4 各組對斷奶仔豬血清應(yīng)激類激素濃度的影響
通過表5數(shù)據(jù)對比可知,各試驗組相較于對照組而言,在增強斷奶仔豬免疫力的方面均有一定的提升。經(jīng)過測定,IgG的濃度在C組明顯增加(P<0.05),而A組和B組的變化雖然有小幅增長但差異并不顯著(P>0.05)。在IgM和IgA的濃度方面,3試驗組與對照組無顯著差異,但都略高于對照組。
表5 各組對斷奶仔豬血清免疫能力的影響
由表6可知,在這些試驗組中,TP含量都明顯升高,其中,A組的變化較為明顯(P<0.05),而B組和C組的相較于A組變化都極為突出(P<0.01)。此外,試驗B組和C組的ALB含量與對照組相比,差異極顯著(P<0.01),其中,B組和C組ALB含量均高于A組,但B組與A組差異顯著(P<0.05),與C組差異極顯著(P<0.01)。經(jīng)過試驗,C組的UREA含量與對照組相比,得到了明顯的改善(P<0.05),其他2組試驗組的UREA含量也都有不同程度的改善趨勢,但不顯著,ALP活性也是如此。此外,試驗得出,AST的活性并無顯著變化,但ALT的活性C組卻顯著升高(P<0.05)。然而,這種變化是屬于可接受的水平的。
表6 各組對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響
SOD,即超氧化物歧化酶,是一種通過分解超氧自由基產(chǎn)生H2O2,從而預(yù)防細(xì)胞損害的金屬酶。SOD分解而得的H2O2,隨后被CAT,即過氧化氫酶,進(jìn)一步降解為H2O[9]。機體中也存在一種名為GSH-Px的過氧化物酶,即谷胱甘肽過氧化物酶,它擁有催化還原型谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)的能力,并且能夠催化脂質(zhì)過氧化物的還原過程,同時也具備分解H2O2的功能。丙二醛(MDA)是細(xì)胞脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物,被用作脂質(zhì)過氧化損傷程度的標(biāo)志物,除此之外,MDA還會進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜流動性以及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物分子的完整性。
白術(shù)、甘草、石榴皮和山楂中含有的黃酮類物質(zhì)可以通過清除自由基提高機體抗氧化能力[10-13]。另有研究表明,益生菌也具有抗氧化的功能。研究證實,酵母菌的代謝物質(zhì)包括氨基酸、維生素和酶,并且它們在胃腸道內(nèi)保持有很強的抵抗失活性,其細(xì)胞和胞質(zhì)內(nèi)更是含有具有抗氧化作用的多糖和蛋白質(zhì)[14]。在該試驗中,與對照組相比,3組添加劑均可以提高GSH-Px、CAT、SOD和T-AOC的活性,并降低MDA的濃度,說明3組添加劑均具有明顯的抗氧化作用,其中,3菌中藥合劑處理的仔豬效果最佳。
下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸在機體處于應(yīng)激狀態(tài)下被激活,從而引起下丘腦分泌出促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH),CRH作用于垂體前葉分泌出促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH),隨后垂體前葉分泌的ACTH經(jīng)由血液運輸至腎上腺合成與釋放糖皮質(zhì)激素。而血液中糖皮質(zhì)激素濃度增加是導(dǎo)致動物體內(nèi)環(huán)境紊亂的主要原因。皮質(zhì)醇(COR)是一種最主要的糖皮質(zhì)激素,能夠提高機體蛋白質(zhì)、脂肪的分解代謝能力,因此機體內(nèi)COR過多會加速蛋白質(zhì)、脂肪的降解,導(dǎo)致機體的氮失衡,抑制了機體的生長。當(dāng)機體處在應(yīng)激狀況下時,由于能量無法充分供應(yīng),肌肉細(xì)胞因缺血、缺氧等原因?qū)е录?xì)胞受到損傷,細(xì)胞通透性增強,細(xì)胞中肌酸磷酸激酶(CK)會流入血液循環(huán)中。因此,血清CK水平能夠衡量機體是否處在應(yīng)激狀態(tài)[15]。
有研究發(fā)現(xiàn),日糧中添加不同益生菌制劑和中藥制劑均能明顯降低機體的COR、CK的水平。在奶牛日糧中添加植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌,在58 d后可以降低COR水平[16]。試驗結(jié)果顯示,相對于對照組,3個試驗組仔豬血清COR、ACTH和CK濃度顯著降低,C組的效果優(yōu)于其他試驗組,表明3種添加劑均具有明顯的抗應(yīng)激功能,其中,3菌中藥合劑效果最好。
血清抗體水平是體液免疫的關(guān)鍵指標(biāo)。大量研究發(fā)現(xiàn),益生菌制劑具有顯著的提高免疫力作用。乳酸菌作為一種有效的益生菌,能在胃酸和膽鹽下存活,黏附并定植在腸上皮細(xì)胞上,能對腸道有害細(xì)菌進(jìn)行競爭性抑制,維持腸道的完整性并刺激宿主的免疫系統(tǒng),以增強宿主對致病菌的免疫力[17-18]。酵母菌和乳酸菌聯(lián)合使用可以引起機體體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答,產(chǎn)生出各種IgG、IgM以及IgA等免疫球蛋白來發(fā)揮作用,提高機體免疫能力[19]。郭林霞等[20]使用棗多糖提取物處理環(huán)磷酰胺所致的蛋雛雞,促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgA。
試驗結(jié)果表明,與對照組相比,3個試驗組仔豬血清IgG、IgM以及IgA濃度均有少量提高,除此之外,C組的IgG濃度顯著高于對照組,表明3菌中藥合劑具有明顯的抗應(yīng)激功能。
血清生化參數(shù)包括機體多種生理、生化指標(biāo),可以一定程度上反映出個體的代謝水平和健康狀況。血清尿素是機體蛋白質(zhì)合成代謝與日糧氨基酸平衡的標(biāo)志,是動物對氮的利用的表達(dá)[21]。何韻秋等[22]提出,添加1 g/kg復(fù)合益生菌可以顯著改善生長期湖羊血清中的總蛋白和球蛋白水平。
該試驗中,與對照組相比,3種飼料添加劑均能降低仔豬血清尿素(UREA)水平,提高總蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)濃度,表明3種飼料添加劑均可以提高仔豬對氮的利用,且C組的效果最佳。
ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)和AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)存在于血清中,是氨基酸轉(zhuǎn)換的主要酶。如果這2種酶的濃度異常升高,可能顯示出肝臟功能出現(xiàn)問題;然而,如果這2種酶的提升幅度在正常范圍內(nèi),這可能意味著體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝可能增強。試驗結(jié)果顯示,除3菌中藥合劑外,其他2種添加劑處理的仔豬ALT、AST濃度無顯著變化,3菌中藥合劑顯著提高ALT、AST濃度,但未超過正常范圍。
堿性磷酸酶(ALP)是一種能參與機體蛋白質(zhì)、脂類代謝過程并含有遺傳標(biāo)記的同工酶,其活性強弱能表明機體生長速度的快慢,與機體日增重呈正相關(guān)[23]。經(jīng)過試驗證明,在使用另外2種添加劑的情況下,仔豬的ALP水平?jīng)]有發(fā)生重大改變,但是在使用3菌中藥合劑添加劑的情況下,ALP水平卻出現(xiàn)了顯著的提高,這說明了這種添加劑有助于增強它們的生長能力。
TC和TG是衡量機體脂質(zhì)代謝水平的重要指標(biāo),它們可以反映出血液中總膽固醇的水平。石榴皮提取物可以調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型TC、TG、FFA、LDL和HDL的水平[24]。使用乳酸菌飼喂小鼠可顯著降低血清中TC、TG、LDL-C濃度[25]。該試驗中3種飼料添加劑均能降低仔豬血清TC、TG的水平,但3種飼料添加劑對仔豬血脂代謝無顯著影響。
以上研究表明,3菌培養(yǎng)物、中藥制劑和3菌中藥合劑都可以調(diào)節(jié)仔豬血液中的相關(guān)指標(biāo),提高它們的抗氧化能力,緩解應(yīng)激,增強它們的免疫力。通過綜合比較分析,3菌培養(yǎng)物與中藥合用的飼料添加劑飼喂效果最佳。