國宇晴, 李晗熙, 白鈴泓, 姜 雯, 廉美蘭, 樸炫春

(延邊大學 農(nóng)學院,吉林 延吉 133002)

何首烏(PolygonummultiforumThunb.)屬于蓼科蓼屬的植物,又名赤首烏、小獨根等,主要分布在黃河以南,以廣東、貴州、四川、湖北等地[1]。何首烏的主要化學成分包括黃酮類、酚類、二苯乙烯苷類、蒽醌類以及磷脂類等[2-4],這些化學成分與抗氧化、抗癌、抗炎等生物活性具有極大相關性[5-9]。有研究表明,黃酮類化合物具有抗氧化活性[10-11]。隨著何首烏需求量的增加,何首烏亂采濫挖的現(xiàn)象日益嚴重,以傳統(tǒng)的種子、塊根、扦插繁殖等方式為主,組織培養(yǎng)方式為輔,但仍存在市場供應與需求量不對等的問題[12]。根據(jù)何首烏離體培養(yǎng)的生長特性,以何首烏不定根進行懸浮培養(yǎng)以期高產(chǎn)[13]。生物反應器是一種快速擴繁的手段[14],因此,采用生物反應器作為快速獲得何首烏不定根材料的途徑,以解決何首烏資源緊缺等問題。

天然產(chǎn)物活性成分的提取是開發(fā)天然產(chǎn)物的關鍵一步[15],傳統(tǒng)提取工藝包括超聲輔助提取法、水加熱提取、超聲波-微波協(xié)同提取法、熱水回流法等[16-20],隨著提取技術具有突破性進展,閃式提取方法逐漸被關注。閃式提取法是一種將植物組織破碎的新型提取技術,依靠高速機械剪切力和超動分子滲透技術,在室溫及溶劑存在下經(jīng)數(shù)秒把植物的各組織破碎以快速提取植物材料中活性物質(zhì)的方法[21-22]。已有研究發(fā)現(xiàn),何首烏提取過程中存在諸多問題,例如傳統(tǒng)提取方法中耗時過長[23]、有機溶劑使用量高[24]等,因此,該試驗采用閃式提取法對反應器培養(yǎng)的何首烏不定根進行提取。為對閃式提取工藝進行優(yōu)化,已有研究表明,響應面法與正交法存在區(qū)別,正交法并不能對各個因素逐一詮釋并且不能對各因素間交互作用進行分析,故無法建立函數(shù)模型,因此無法明確最優(yōu)方案,而響應面可用于評估各種試驗過程中的多個參數(shù)以及各個變量之間的交互作用,可經(jīng)建立函數(shù)關系確定最優(yōu)組合[25-30],故通過響應面法對閃式提取工藝進行優(yōu)化。

該試驗以生物反應器培養(yǎng)的何首烏不定根為植物材料,利用閃式提取法對不定根中總黃酮進行提取,以不定根提取物的總黃酮含量為指標通過響應面法進行優(yōu)化,并利用體外抗氧化方法對何首烏不定根抗氧化活性做出評價,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力與2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力評價其抗氧化活性,為進一步開發(fā)何首烏不定根資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

將10 g新鮮的何首烏不定根接種于3 L反應器內(nèi)(含有2 L培養(yǎng)液),培養(yǎng)基為MS+2 mg/L IBA+50 g/L蔗糖,pH值調(diào)節(jié)為5.8,通氣量為0.1 vvm,25 ℃條件下暗培養(yǎng)60 d,收獲后將不定根用自來水清洗,置于45 ℃恒溫干燥箱中烘干48 h,即得何首烏不定根干品。

1.2 黃酮閃式提取工藝的研究

試驗用閃式提取儀(上海釩幟精密設備有限公司)提取。將3 g不定根干品以及提取溶劑放置于容器內(nèi),提取時閃式提取儀電壓為220 V,轉(zhuǎn)數(shù)5 000 r/min,通過對提取溶劑、閃式提取時間、提取溶劑濃度以及液料比的調(diào)控,優(yōu)化提取工藝。經(jīng)閃式提取儀提取后過300目篩,收集濾液,45 ℃烘干箱中烘干至恒重,稱重并計算提取率,利用硝酸鋁比色法測定提取物的黃酮含量,最后計算黃酮得率,以此作為確定提取條件的指標。

黃酮得率/%=黃酮含量/(mg·g-1)×提取率/%×0.001.

1.2.1 單因素試驗

1) 提取溶劑的篩選：提取溶劑為80%甲醇、80%乙醇及蒸餾水,液料比為40∶ 1 (mL∶g),提取時間50 s。

2) 溶劑濃度的篩選：將提取溶劑(乙醇)濃度設置為20%,40%,60%,80%和100%,液料比為40∶1 (mL∶g),提取時間為50 s。

3) 提取液料比的篩選：將液料比分別設置為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 (mL∶g),提取時間為50 s,依據(jù)上述試驗結果使用60%的乙醇作為提取溶劑濃度。

4) 提取時間的篩選：將提取時間設置為30、40、50、60、70 s,依據(jù)上述試驗結果使用60%的乙醇作為提取溶劑濃度,液料比為50∶1 (mL∶g)。

1.2.2 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上,以提取時間(A),溶劑濃度(B),液料比(C) 3個因素為自變量,以提取物中黃酮得率為響應值,依據(jù)Box-Behnken法進行3因素3水平試驗設計(表1),共計15個組合[31]。按照各組合條件進行閃式提取,后對給予的優(yōu)化組合進行3次重復的驗證試驗,確定最佳提取工藝。

表1 響應面試驗因素及水平

1.2.3 總黃酮的測定

根據(jù)張超等[32]測量總黃酮方法,應用硝酸鋁比色法測定總黃酮含量,以蘆丁為標準品。稱取蘆丁標準品10 mg置于容器內(nèi),加入70%乙醇溶解,并定容至250 mL。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 mL的蘆丁溶液于試管內(nèi),用70%乙醇定容至2 mL。依次向試管中加入0.3 mL的5%NaNO2,靜置6 min后;再加入0.3 mL 10%Al(OH)3溶液,靜置6 min。最后,加入2.0 mL 4%NaOH溶液。于510 nm處測定OD值,繪制標準曲線。

稱取0.01 g不定根提取物,用70%乙醇溶解并定容至25 mL后,取0.2 mL至試管中并定容至2 mL,按標準品操作流程,分別加入等量的3種溶液,于510 nm處測定液體OD值。

總黃酮含量/(mg·g-1)=CVD/m,

式中,C為提取物溶液中總黃酮濃度/(mg·mL-1),V為樣品溶液體積/mL,D為液體稀釋倍數(shù),m為提取物樣品質(zhì)量/g。

1.3 抗氧化測定

1.3.1 DPPH自由基清除能力測定

根據(jù)參考文獻[33]的方法并稍作修改。將待測樣品溶解于去離子水中通過二倍稀釋法稀釋為不同濃度的待測樣液,吸取100 μL待測樣液,加入至100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液于96孔板中并混勻,室溫避光靜置30 min后,在波長517 nm處測定吸光度。用去離子水代替樣液作為空白,用VC代替樣液作為陽性對照,每個濃度平行測定3次后取平均值,根據(jù)下式計算樣品對DPPH自由基的清除率,并根據(jù)不同濃度提取物的清除能力計算得到半數(shù)抑制濃度(EC50)。

DPPH自由基清除率/%=A0/A1×100%,

式中,A0為空白吸光度;A1為樣品以及VC與DPPH溶液反應后的吸光度。

1.3.2 ABTS自由基清除能力的測定

參考Hui[34]的方法并稍作修改。將2.45 mmol/L過硫酸鉀與7.0 mmol/L ABTS溶液按體積比1︰1混合均勻后,室溫避光過夜放置12～16 h,使用前用無水乙醇稀釋至波長734 nm處吸光度為0.7±0.02,即為ABTS工作液。將待測樣品溶解并稀釋成不同濃度的待測樣液, 吸取50 μL待測樣液與150 μL ABTS于96孔板內(nèi)混勻,在黑暗條件下反應30 min,在波長734 nm處測定其吸光度。用甲醇代替樣液作為空白,用VC代替樣液作為陽性對照,每個濃度平行測定3次后取平均值,根據(jù)下式計算樣品對ABTS自由基清除率,得到半數(shù)抑制濃度(EC50)。

ABTS自由基清除率/%=(A0-A1)/A0×100,

式中,A0為空白吸光度;A1為樣品以及VC與ABTS工作液反應后的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次,利用SPSS 25.0軟件程序?qū)我蛩卦囼炛酗@著性差異進行分析,Design Expert 10.0進行響應面分析,GraphPad Prism 8.0軟件繪制單因素試驗以及DPPH自由基、ABTS自由基清除試驗圖,顯著水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 閃式提取溶劑對何首烏不定根總黃酮含量的影響

該研究通過閃式提取法進行提取,首先對提取溶劑進行優(yōu)化。

由圖1可知,當溶劑為乙醇時,何首烏不定根總黃酮得率達到最高,并顯著高于甲醇與水溶劑的黃酮得率,選擇有機溶劑作為提取溶劑,導致黃酮得率較高的原因可能是雜質(zhì)較少[35],因此,該試驗選擇乙醇作為提取溶劑進行下一步試驗。

注：數(shù)值為平均值±標準偏差(n=3)。

2.1.2 不同提取條件對何首烏不定根總黃酮含量的影響

經(jīng)上述試驗選擇乙醇為提取溶劑后,對乙醇濃度進行篩選。分別設置乙醇濃度為20%、40%、60%、80%和100%等5個處理,由圖2-A可知,總黃酮得率隨著乙醇濃度的升高呈先增長后下降的趨勢,當乙醇濃度為60%時,黃酮得率達到最高,為15.5 %,當乙醇濃度為80%以及100%時,何首烏不定根黃酮得率反而降低,這可能與黃酮的組成有關系,由此可以推測,何首烏不定根中的黃酮類物質(zhì)具有極性[36],因此,確定60%乙醇為最佳處理。

圖2 不同提取條件對黃酮得率的影響

確定使用60%乙醇為溶劑進行提取后,對液料比條件進行篩選。液料比為60%溶劑用量(mL)與不定根干品(g)的比值,試驗將設置以下5個處理：20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 (mL∶g)。如圖2-B所示,黃酮得率隨料液比增長而增長,在50∶1 (mL∶g)時達到最高,為22.88%,隨后在液料比達到60∶1 (mL∶g)時,黃酮得率下降且達到最低,這可能是因為更多的溶劑會降低溶解在溶劑中的活性物質(zhì)的傳質(zhì)阻力[37]。因此,選擇液料比為50∶1 (mL∶g)進行下一步試驗。

經(jīng)上述試驗發(fā)現(xiàn),應通過60%乙醇且液料比為50∶1 (mL∶g)進行提取,為了探明時間對閃式提取何首烏不定根黃酮得率的影響,設置提取時間分別為：30、40、50、60和70 s。通過圖2-C可以看出,黃酮得率隨時間的增加而升高,在50 s后趨于穩(wěn)定,且與60和70 s差異不顯著,可能因為在達到最優(yōu)處理時間后會存在顆粒過細等問題導致時間過長而黃酮得率降低[38],并且由于50 s更為節(jié)省時間,因此,選擇50 s為最佳條件,進行下一步響應面優(yōu)化。

根據(jù)單因素試驗結果,擇出60%乙醇為提取溶劑,閃式提取時間50 s,液料比50∶1 (mL∶g)。

2.2 提取條件優(yōu)化研究

將上述單因素試驗作為基礎,通過響應面分析法的Box-Behnken Design方法,進行3因素3水平的試驗設計(表2),以溶劑濃度、提取時間及液料比為自變量,黃酮得率為響應值,結果表明存在差異,經(jīng)多元擬合回歸分析,得到二次回歸模型方程：

表2 響應面試驗結果

Y=24.62+1.56A+1.71B+1.24C+0.86AB-0.02AC+0.02BC-4.69A2-3.66B2-3.44C2,

式中,A、B及C分別為提取時間、溶劑濃度及液料比,Y為何首烏不定根黃酮得率的預測值。

圖3 兩因素交互作用對黃酮得率的影響

表3 方差分析結果

通過響應面分析法,對試驗數(shù)據(jù)繪制多元二次回歸方程,即得最優(yōu)條件參數(shù)[39]。該試驗通過對何首烏不定根閃式提取進行3因素3水平的響應面分析,結果表明回歸模型充分擬合試驗數(shù)據(jù),故應用此模型分析結果以優(yōu)化何首烏不定根閃式提取工藝?；貧w模型求解后最優(yōu)提取工藝各參數(shù)分別為：提取時間51.9 s、溶劑濃度65.1%、液料比51.8∶1(mL∶g),此時響應值(黃酮得率)的預測值為25.1 %。

2.3 工藝條件優(yōu)化及驗證

為驗證試驗結果的可靠度,該試驗進行3次平行試驗對求解結果進行驗證。由表4可知,3次重復試驗的黃酮得率為28.74%、29.83%和31.91%,相對標準偏差為0.66 %,表明3次重復試驗結果穩(wěn)定,與預測值吻合。

表4 驗證試驗結果

2.4 何首烏不定根抗氧化活性測定

2.4.1 對DPPH自由基清除能力

為了評價何首烏不定根抗氧化活性,通過對DPPH清除能力判斷其抗氧化活性,當抗氧化劑與呈紫色DPPH自由基結合時,溶液由深紫色變?yōu)榈S色,說明具備抗氧化能力[40]。由圖4可知,何首烏不定根粗提物(PMCE)對DPPH自由基清除能力隨提取物濃度增大而提高,且達到最高后趨于平穩(wěn)。通過計算可知,PMCE的EC50為25.9 μg/mL,VC的EC50則為10.8 μg/mL,與VC相差較小。

圖4 粗提物對DPPH自由基清除能力

圖5 粗提物對ABTS自由基清除能力

2.4.2 對ABTS自由基清除能力

ABTS自由基清除試驗作為供氫抗氧化劑或斷鏈抗氧化劑用于測定抗氧化活性[41]。由圖7可知,PMCE對ABTS自由基的清除能力隨濃度增加而增強,當濃度為2 mg/mL時,清除率最高,為99%,由此計算得出PMCE的EC50為148.5 μg/mL,具有良好的清除能力。

3 討論與結論

在閃式提取過程中被類似于提取溶劑、提取時間等因素影響提取結果,且需要考慮兩種因素間的交互作用,因此采用Box-Behnken響應面法對閃式提取工藝進行優(yōu)化[42-44]。徐亞男等[45]以多糖得率為指標,通過響應面法對閃式提取狼毒大戟愈傷組進行工藝優(yōu)化,結果表明,液料比為39.967∶1 (mL∶g),提取時間為50.128 s,提取水溫為52.034 ℃。張鋒等[46]研究發(fā)現(xiàn),響應面優(yōu)化閃式提取無花果葉總黃酮工藝最優(yōu)方案結果為：提取時間87 s,乙醇體積分數(shù)67%,液料比87∶1 (mL∶g)。李學峰等[47]通過調(diào)控閃式提取的幾種因素對貫葉連翹不定根黃酮提取工藝進行了優(yōu)化,經(jīng)響應面法分析后得出結論：77.46%甲醇在液料比52.13∶1 (mL∶g),提取65.44 s時,黃酮得率最高。基于上述試驗結論說明響應面法優(yōu)化閃式提取工藝具有可行性。

周新新等[48]對枳實總黃酮進行提取工藝優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)閃式提取法以50%乙醇為溶劑為最優(yōu)溶劑。趙成萍等[49]經(jīng)響應面法優(yōu)化閃式提取山楂果肉總黃酮工藝發(fā)現(xiàn),最佳條件為66%乙醇,液料比44∶1 (mL∶g)、提取時間74 s,其提取溶劑與溶劑濃度與該試驗研究結果相似。

閃式提取法突出特點為快速、簡易地達到提取天然產(chǎn)物,但具體提取條件仍存在差異,例如當料液比增高時會降低溶解在溶劑中的活性物質(zhì)的傳質(zhì)阻力,進而提高傳質(zhì)速率,從而提高目標化合物的產(chǎn)率,但過量的溶劑會導致更多的雜質(zhì)溶解使目標產(chǎn)物得率降低[50];當處理時間超過最佳值時會因為熱積累或者導致顆粒過細,從而導致提取物黃酮得率在提取時間到達最佳后未出現(xiàn)顯著差異[38],上述過程會導致目標化合物的損失,這與該單因素試驗趨勢相同。該試驗結果表明,響應面法優(yōu)化閃式提取何首烏不定根總黃酮最優(yōu)工藝為提取時間51.90 s,溶劑濃度65.1%,液料比51.8∶1 (mL∶g),當何首烏不定根粗提物濃度為0.5 mg/mL時,DPPH自由基清除率達到75%,當濃度為2 mg/mL時,對ABTS自由基清除率達到99 %。