王夢(mèng)文, 杜佳霖, 董 睿, 李鵬博, 李 銅, 金光德, 南桂仙

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

白鮮(DictamnusdasycarpusTurcz.)屬蕓香科白鮮屬多年生宿根草本植物,其根部入藥,又稱白鮮皮、山牡丹等,經(jīng)常用于治療濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風(fēng)疹等疾病[1],還被證實(shí)有抗炎、抗真菌、止血、抗癌等藥理作用[2],因此,其需求量不斷增加。近年研究表明,白鮮堿等生物堿類,黃柏酮、梣酮等檸檬苦素類化合物為白鮮主要有效成分[3],具有多種生物活性。其中,白鮮堿具有強(qiáng)心、抗蟲、抗真菌等活性[4-5],黃柏酮具有抗癌、抗腫瘤的細(xì)胞毒性等活性[6-7];梣酮具有良好的護(hù)肝作用,同時(shí)具有抗菌、殺蟲等活性[8-11]。在中國(guó)、韓國(guó)和日本多用于治療皮膚疾病[12]。由于對(duì)野生白鮮的過度開發(fā),導(dǎo)致白鮮產(chǎn)量供不應(yīng)求,如何合理利用藥用資源提取更多的次生代謝產(chǎn)物是該試驗(yàn)的目的與初衷。

目前,誘導(dǎo)子在藥用植物次生代謝產(chǎn)物的提升方面被廣泛應(yīng)用,誘導(dǎo)子從來(lái)源上可分為外源性和內(nèi)源性,根據(jù)性質(zhì)可分為生物型和非生物型[13]。利用不同誘導(dǎo)子影響白鮮幼苗以提高其藥用成分含量(白鮮堿、梣酮、黃柏酮)和次生代謝產(chǎn)物的研究報(bào)告愈發(fā)增多。其中,AgNO3作為常用的外源誘導(dǎo)子,已應(yīng)用于藥用植物促進(jìn)其生長(zhǎng)和提升次生代謝產(chǎn)物的研究。但是,目前其對(duì)于白鮮生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。張志軍等[14]的研究表明,AgNO3對(duì)馬鈴薯幼苗的根長(zhǎng)有促進(jìn)作用;許建民等[15]的研究表明,AgNO3對(duì)草莓組培苗的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,郭雙等[16]研究表明,AgNO3可提高顛茄毛狀根中的生物堿含量。該試驗(yàn)以白鮮種子作為試驗(yàn)材料,探究經(jīng)不同濃度AgNO3處理后對(duì)白鮮試管無(wú)菌苗生長(zhǎng)以及藥用成分含量的影響,以期為白鮮次生代謝產(chǎn)物調(diào)控研究與規(guī)?；a(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

該試驗(yàn)的植物材料為白鮮種子,采收于安圖白鮮栽培地。

儀器和試劑：SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、1260高效液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography,HPLC,美國(guó)安捷倫公司)、SB-120D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)、乙醇、甲醇(色譜純)、AgNO3(上海麥克林生化科技股份有限公司)、蒸餾水、MS培養(yǎng)基粉(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)、白鮮堿標(biāo)準(zhǔn)品、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品、梣酮標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司),無(wú)特殊標(biāo)記外的試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將消毒后的白鮮種子點(diǎn)在MS培養(yǎng)基中,待種子發(fā)芽后分別移到附加不同濃度AgNO3誘導(dǎo)子的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng),濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、50、100、150 μmol/L,以不加誘導(dǎo)子的MS培養(yǎng)基為對(duì)照(CK),每個(gè)培養(yǎng)基點(diǎn)10粒種子,4個(gè)培養(yǎng)基為1組,重復(fù)3次,培養(yǎng)30 d后觀察白鮮幼苗生長(zhǎng)情況,其中添加AgNO3誘導(dǎo)子的培養(yǎng)基先暗培10 d再進(jìn)行光照,CK培養(yǎng)方式相同。培養(yǎng)溫度(24±1) ℃,光照時(shí)間14 h/d。

1.2.2 計(jì)算方法

該試驗(yàn)對(duì)白鮮幼苗根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)、鮮重凈增量、干重凈增量進(jìn)行測(cè)量。其中,在測(cè)定根長(zhǎng)時(shí)一組為20個(gè)幼苗根長(zhǎng)平均值,在統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)時(shí)一組為20個(gè)幼苗側(cè)根數(shù)平均值,上述每個(gè)處理重復(fù)4次。鮮重凈增量=處理后10棵幼苗鮮重-處理前10粒種子鮮重;干重凈增量=處理后10棵幼苗干重-處理前10粒種子干重。

1.2.3 檢測(cè)方法與色譜條件

該試驗(yàn)采用加熱回流裝置和高效液相色譜法檢測(cè)白鮮中的白鮮堿、梣酮、黃柏酮含量。檢測(cè)方法參考賈曉龍[17]的試驗(yàn)方法,色譜條件：色譜柱為YMC-Triart-C18(250 mm×4.60 mm, 5 μm);流動(dòng)相為甲醇(55)：水(45),流速 1 mL/min;白鮮堿、梣酮檢測(cè)波長(zhǎng)為 236 nm,黃柏酮檢測(cè)波長(zhǎng)為 212 nm[18];色譜柱溫度25 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

1.3 溶液的制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品母液

將50 mg白鮮堿、梣酮、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品加入甲醇中定容至50 mL,制得濃度為1 mg/mL的母液。

1.3.2 待測(cè)樣品溶液

將植物樣品放入烘干箱55 ℃烘干3～4 h,溫度提高到100 ℃烘干1～2 h,冷卻后研磨,取1.0 g樣品,放入錐形瓶中,加入甲醇25 mL,加熱回流1 h,水浴溫度60 ℃,冷卻取混合液補(bǔ)充少量甲醇并通過0.22 μm微孔過濾,即得樣品待測(cè)液。每個(gè)濃度重復(fù)3次。

1.4 線性關(guān)系的考察

分別吸取適量的白鮮堿、梣酮、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品母液分別置于20 mL容量瓶中,加入甲醇定容,分別得到不同質(zhì)量濃度的白鮮堿、梣酮、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液,此時(shí)白鮮堿的質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 μg/mL;梣酮的質(zhì)量濃度為5、25、45、65、85、105、125、145 μg/mL;黃柏酮的質(zhì)量濃度為15、45、75、105、135、165、195 μg/mL。取得不同質(zhì)量濃度的白鮮堿、梣酮、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液后,在1.2.3的色譜條件下測(cè)定峰值。以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo),峰面積值Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對(duì)峰面積的回歸方程(表1)。

表1 白鮮堿、梣酮、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對(duì)峰面積的回歸方程

表2 檢測(cè)供試驗(yàn)品中白鮮堿、梣酮、黃柏酮含量的重復(fù)性試驗(yàn)

1.5 精密度試驗(yàn)

分別取0.1 mg/mL的白鮮堿、梣酮、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品母液,在1.2.3的色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行檢測(cè),白鮮的峰面積平均值為1 348 416.667、梣酮的峰面積的平均值為1 001 977.56、黃柏酮的峰面積平均值1 999 289.333,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.67%、1.59%、1.38%,均<2%,結(jié)果說明精密度好,符合分析要求。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一濃度處理的白鮮幼苗,按照“1.3.2”流程制作供試樣品溶液,在1.2.3色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)定并計(jì)算白鮮堿、梣酮、黃柏酮含量的RSD,均<2%,結(jié)果表明重復(fù)性很穩(wěn)定,符合分析的要求。

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

該試驗(yàn)采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總,SPSS 26統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度AgNO3對(duì)白鮮試管無(wú)菌苗生長(zhǎng)的影響

2.1.1 不同濃度AgNO3對(duì)白鮮試管無(wú)菌苗根部生長(zhǎng)的影響

不同濃度AgNO3處理后白鮮試管無(wú)菌苗根的生長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)均出現(xiàn)了顯著差異(表3)。白鮮幼苗的根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)隨著AgNO3濃度的增加呈現(xiàn)先提升后減少的趨勢(shì)。

由表3可知,AgNO3所有濃度處理后均對(duì)白鮮幼苗根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,所用濃度處理根的生長(zhǎng)都顯著優(yōu)于CK。在10 μmol/L時(shí)根長(zhǎng)達(dá)到最大值,長(zhǎng)度為8.75 cm,在0.1 μmol/L較低濃度的時(shí)候,根長(zhǎng)最低,長(zhǎng)度為5.64 cm。所有AgNO3濃度處理后側(cè)根數(shù)均顯著高于CK,在0.5 μmol/L時(shí),白鮮幼苗側(cè)根數(shù)最多,為2.43條,在濃度為50 μmol/L時(shí),側(cè)根數(shù)顯著下降,到150 μmol/L時(shí),達(dá)到最低值。

2.1.2 不同濃度AgNO3對(duì)白鮮試管無(wú)菌苗鮮重和干重的影響

不同濃度AgNO3處理下的幼苗鮮重凈增量均高于CK(表4)。AgNO3濃度為0.5 μmol/L時(shí),鮮重凈增量最多,平均重量為1 036.13 mg。AgNO3各濃度處理后干重凈增量均高于CK。AgNO3濃度為0.5 μmol/L時(shí),干重凈增量達(dá)到最高值,重量為146.93mg。濃度為150 μmol/L時(shí),在所用濃度處理中干重凈增量最低。

表4 不同濃度硝酸銀處理后的白鮮幼苗的鮮重和干重凈增量

2.2 不同濃度AgNO3對(duì)白鮮試管無(wú)菌苗藥用成分含量的影響

不同濃度AgNO3處理后白鮮幼苗中的3種藥用成分含量均產(chǎn)生了顯著差異(表5)。3種藥用成分含量隨著AgNO3濃度的增加整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在AgNO3濃度為50 μmol/L時(shí),白鮮堿含量達(dá)到最大值,為317.40 μg/g,在AgNO3濃度為0.1 μmol/L時(shí),相比其他濃度處理白鮮堿含量最少,為117.11 μg/g,但顯著高于CK。在AgNO3濃度為1 μmol/L時(shí),梣酮含量最高,為201.16 μg/g,在濃度為5 μmol/L時(shí),開始緩慢下降。在AgNO3濃度為150 μmol/L時(shí),梣酮含量達(dá)到最低。在AgNO3濃度為0.5 μmol/L時(shí),黃柏酮含量達(dá)到最大值,為374.42 μg/g,當(dāng)濃度為1 μmol/L時(shí),黃柏酮含量緩慢降低,到50 μmol/L時(shí),黃柏酮含量顯著低于CK。

表5 不同濃度硝酸銀處理對(duì)白鮮中白鮮堿、梣酮、黃柏酮的影響

2.3 不同濃度AgNO3對(duì)白鮮試管無(wú)菌苗生長(zhǎng)和藥用成分含量的主成分分析

以不同濃度AgNO3處理后白鮮幼苗根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)、生物量和3種藥用成分含量共7個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析,通過綜合評(píng)價(jià)篩選出AgNO3的最佳濃度。將上述各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后,計(jì)算相關(guān)矩陣的特征值和所對(duì)應(yīng)的特征向量(表6)。

表6 相關(guān)矩陣特征值和特征向量

結(jié)果表明,前3項(xiàng)綜合指數(shù)的特征值>1,積累貢獻(xiàn)率為93.48%,因此可代表原來(lái)的所有指標(biāo)絕大部分信息。主成分1主要綜合了側(cè)根數(shù)(0.930)、干重凈增量(0.833)、梣酮含量(0.659)和黃柏酮(0.764),代表原始數(shù)據(jù)信息量的49.075 %,主成分2主要綜合了根長(zhǎng)(0.778)和白鮮堿含量(0.886),代表原始數(shù)據(jù)信息量的27.253 %,主成分3為鮮重凈增量(0.664),代表原始數(shù)據(jù)信息量的17.152 %。

由AgNO3所有濃度處理后的綜合得分排名可知,AgNO3對(duì)白鮮生長(zhǎng)和3種藥用成分總含量促進(jìn)作用最為明顯的濃度為0.5 μmol/L,其次是5 μmol/L、10 μmol/L(表7)。

表7 硝酸銀各濃度主成分得分及綜合排名

3 討論與結(jié)論

藥用植物是生產(chǎn)多種天然化合物的高等植物種類[19],根據(jù)主效成分劃分為黃酮類、 生物堿類等植物[20]。白鋼等[21]認(rèn)為,植物中的特殊藥用成分能增強(qiáng)體質(zhì)、改善臟腑功能。藥用植物是中藥的重要組成部分,我國(guó)對(duì)藥用植物的需求量非常巨大[22]。白鮮中的藥用成分具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒之功,可用于濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風(fēng)疹、疥癬瘡癩、風(fēng)濕熱痹、黃疸尿赤等[23]。隨著白鮮皮的廣泛應(yīng)用,價(jià)格呈逐年上漲趨勢(shì),在東北三省及內(nèi)蒙古等地區(qū)進(jìn)行人工栽培,但由于相關(guān)生產(chǎn)操作規(guī)范不完善,市場(chǎng)流通的白鮮皮飲片有效成分含量不穩(wěn)定,部分飲片不符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[24]。冷豆豆等[25]認(rèn)為,通過誘導(dǎo)子可以調(diào)控植物代謝途徑和藥用含量。AgNO3作為常用的誘導(dǎo)子,是乙烯合成酶ACC的一種抑制劑[26],Ag+不僅可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性[27],還能促進(jìn)植物再生、促進(jìn)根的生長(zhǎng)[28]。劉佳等[29]研究發(fā)現(xiàn),AgNO3濃度在50、100 μmol/L時(shí),均顯著性地提高了托品烷類生物堿的產(chǎn)量;高湖川[30]試驗(yàn)表明,AgNO3濃度在50 μmol/L時(shí),喜樹堿的含量相對(duì)增加 70.28%;李婷婷等[31]試驗(yàn)證明,AgNO3濃度在0.4g/L時(shí),抑制刺梨葉片愈傷組織褐化的效果最好;前人的研究結(jié)果表明, AgNO3對(duì)植物的次生代謝有調(diào)控作用,與該試驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。但因AgNO3為有毒物質(zhì),利用不同濃度的AgNO3處理白鮮種子后白鮮幼苗中AgNO3殘留的毒性大小尚未檢測(cè),如何消除AgNO3殘留的毒性有待研究。此外,AgNO3在50～150 μmol/L時(shí),濃度跨度較大,在這之中是否還有更具體的濃度變化值仍需進(jìn)一步探究。

用不同濃度AgNO3處理白鮮已萌發(fā)種子,30 d后測(cè)定了白鮮幼苗根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)、干重凈增量、鮮重凈增量和3種藥用成分含量,對(duì)測(cè)定得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果產(chǎn)生了顯著差異。對(duì)不同濃度AgNO3處理下白鮮幼苗的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析,結(jié)果表明0.5 μmol/L AgNO3處理下各項(xiàng)指標(biāo)的綜合排名最高。