呂燕玲

(廈門市園林植物園，福建 廈門 361003)

花期不遇、花粉活力差等問題常導致雜交失敗，是雜交育種的主要難題[1]?；ǚ圩鳛殡s交育種的重要材料，其活性是雜交育種成功的關(guān)鍵因素之一，以花粉活力較高的種類作為親本，可提高雜交成功率?；ǚ垭x體保存是解決雜交中花期不遇的有效途徑，但保存的花粉能否保持活力，則需要通過測定花粉活性來判斷?；ǚ垭x體培養(yǎng)法是目前檢測花粉活性、育性的最佳方法[2]。在離體培養(yǎng)基中需添加蔗糖、硼酸、聚乙二醇(PEG)、鈣離子等成分。但由于植物種類不同，最適合其花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基成分及濃度也存在差異[2—3]。

鐵甲秋海棠Begoniamasoniana是秋海棠科秋海棠屬植物，在中國廣西和越南北部均有分布，主要生于石灰?guī)r石上或林下潮濕處[4]。其葉片斑紋奇特[5]，是優(yōu)良的景觀植物[6]。有關(guān)鐵甲秋海棠的研究，主要集中在扦插繁殖[7]、組培快繁[8]、斑葉形成原因[9]等方面。未見鐵甲秋海棠花粉離體培養(yǎng)方面的相關(guān)報道。關(guān)于本屬其他種類秋海棠的花粉離體培養(yǎng)及花粉活力測定的報道也較少[10—14]。為此，本研究以鐵甲秋海棠花粉為材料，探討其花粉離體萌發(fā)及花粉管生長的基本培養(yǎng)基條件，以期為鐵甲秋海棠及同屬其他秋海棠的花粉研究和雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為鐵甲秋海棠花粉，供試植株種植于廈門市園林植物園引種馴化區(qū)保育溫室內(nèi)。于晴天上午9:00～10:00，選取生長健壯、長勢良好的植株，采集開放1～2 d 的鐵甲秋海棠花朵，取雄蕊置于25～26 ℃烘箱3～3.5 h，烘干至花粉剛剛散出為宜。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

試驗設計采用單因素分析，對鐵甲秋海棠花粉液體培養(yǎng)基組分蔗糖、硼酸、PEG-4000、氯化鈣進行篩選。先以0.003%硼酸、3% PEG-4000、0.003%氯化鈣為固定培養(yǎng)液條件，然后依次按蔗糖、硼酸、PEG-4000、氯化鈣分別探究各組分不同濃度對鐵甲秋海棠花粉離體萌發(fā)的影響，培養(yǎng)基各組分濃度(質(zhì)量分數(shù))梯度設置如表1。

表1 基本培養(yǎng)基中各組分添加量Table 1 The amount of each component added in the basic medium

觀察最佳培養(yǎng)基中鐵甲秋海棠花粉在不同培養(yǎng)時間下的萌發(fā)情況。培養(yǎng)時間設置為30、60、90、120、140 min。

1.2.2 培養(yǎng)方法

參考周瑾等[2]、楊延紅等[15]的方法并加以改進，取50 μL 培養(yǎng)液，置于載玻片凹槽處，用鑷子夾取少量花粉，將其抖落在培養(yǎng)基上，用干凈的牙簽攪動至花粉均勻分布在培養(yǎng)基表面。將制好的載玻片放置于鋪有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中并加蓋培養(yǎng)，于25 ℃人工氣候箱中暗培養(yǎng)0～140 min，每處理重復3 次。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用Axiolab 5 正置顯微鏡，觀察、測量、拍照保存，并根據(jù)圖片統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。每處理選取5個視野進行觀察，每處理3 次重復。每個視野中花粉粒數(shù)量大于100 粒，花粉管長度大于花粉粒直徑則記為已萌發(fā)[2]。每個視野隨機選取20 個花粉管測量長度。

利用 SPSS 18.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析法及Dunnett’s 進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基篩選

2.1.1 蔗糖濃度對鐵甲秋海棠花粉離體萌發(fā)的影響

由表2 可知，蔗糖濃度對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)和花粉管的生長影響顯著。當蔗糖濃度為5%時，花粉萌發(fā)率最高78.69%，此時，花粉管長度也最長，為491.22 μm；當濃度高于10%時，花粉萌發(fā)率下降至66.15%，花粉管生長也受到明顯抑制，僅為313.3 μm；當蔗糖濃度增加到15%時，抑制效果最明顯，花粉無法正常萌發(fā)和生長。因此，鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)最佳蔗糖濃度為5%，濃度過高或過低，均會抑制鐵甲秋海棠的花粉萌發(fā)。

表2 蔗糖濃度對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的影響Table 2 Effect of sucrose concentration on pollen germination of Begonia masoniana

2.1.2 硼酸濃度對鐵甲秋海棠花粉離體培養(yǎng)的影響

由表3 可知，在一定范圍內(nèi)，鐵甲秋海棠花粉的萌發(fā)率隨硼酸濃度(0.000～0.010%)增加而升高。不同硼酸濃度條件下的鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)率差異顯著。當硼酸濃度為0.010%時，花粉萌發(fā)率可達85.24%，硼酸濃度為0.015%時，花粉萌發(fā)受抑制；隨著硼酸濃度繼續(xù)升高，差異更加顯著。當硼酸濃度為0.010%時，花粉管長度達最大值509.79 μm；硼酸濃度為0.005%與0.010%時，花粉管長度差異不顯著；當硼酸濃度達0.015%時，花粉管生長受到一定程度抑制；當硼酸濃度超過0.020%時，花粉管生長狀態(tài)不良，部分花粉管呈波浪形。綜上，適合鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的硼酸濃度為0.010%。

表3 硼酸濃度對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的影響Table 3 Effect of boric acid concentration on pollen germination of Begonia masoniana

2.1.3 PEG-4000 濃度對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的影響

由表4 可知，PEG-4000 對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響總體趨勢與蔗糖一致，各濃度間差異顯著。在一定范圍內(nèi)，鐵甲秋海棠花粉的萌發(fā)率及花粉管長度隨PEG-4000 濃度升高而增加。當PEG-4000 濃度為5%時，花粉萌發(fā)率最高，可達89.79%，此時，花粉管長度也達最大值506.86 μm。當濃度高于10%時，花粉萌發(fā)和花粉管生長受抑制，當濃度增至20%時，抑制效果最明顯。因此，鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)最佳 PEG-4000 濃度為 5%。PEG-4000 濃度過高或過低對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)均不利。

表4 PEG-4000 濃度對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的影響Table 4 Effect of PEG-4000 concentration on pollen germination of Begonia masoniana

2.1.4 氯化鈣濃度對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的影響

由表5 可知，當氯化鈣濃度為0.003%時，花粉萌發(fā)率最高，達89.95%，顯著高于對照；但氯化鈣濃度為0.003%～0.010%時，花粉萌發(fā)率差異不顯著。因此，氯化鈣濃度在0.003%～0.010%范圍內(nèi)可促進鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)。當氯化鈣濃度達0.020%時，花粉萌發(fā)受抑制；當濃度為0.040%時，抑制效果更加顯著。隨著氯化鈣濃度的增加，鐵甲秋海棠花粉管長度的變化呈先升高后下降的趨勢。當濃度為0.003%時，花粉管長度最長，達508.76 μm；當濃度增至0.005%時，花粉管生長開始受抑制。綜上，鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)和花粉管生長的最佳氯化鈣濃度為0.003%。

表5 氯化鈣濃度對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的影響Table 5 Effect of calcium concentration on pollen germination of Begonia masoniana

2.2 培養(yǎng)時間

由2.1 篩選出鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為5%蔗糖+ 0.010%硼酸+ 5% PEG-4000+ 0.003%氯化鈣，在此條件下培養(yǎng)30 min，花粉開始萌動(此時花粉管長度小于花粉粒直徑，視為不萌發(fā))；培養(yǎng)60 min 少量萌發(fā)；培養(yǎng)90 min 超過50%花粉萌發(fā)，花粉管顯著伸長；培養(yǎng)120 min 萌發(fā)率基本趨于穩(wěn)定，此時花粉管生長狀態(tài)良好，花粉萌發(fā)率達90.86%，花粉管長度達511.51 μm；培養(yǎng)140 min 花粉萌發(fā)率不再升高，花粉管繼續(xù)生長，達538.89 μm(表6、圖1)。因此，鐵甲秋海棠花粉離體培養(yǎng)的最佳時間為120 min，超過120 min 花粉萌發(fā)率變化不明顯，且花粉管長度太長，不利于觀察統(tǒng)計。

圖1 鐵甲秋海棠花粉不同培養(yǎng)時間的萌發(fā)情況Fig. 1 Pollen germination of Begonia masoniana at different culture time

表6 培養(yǎng)時間對鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的影響Table 6 Effect of culture time on pollen germination of Begonia masoniana

3 討論

蔗糖不僅是花粉粒萌發(fā)的主要營養(yǎng)來源，還可在花粉萌發(fā)過程中調(diào)節(jié)花粉細胞滲透壓[15]。研究表明，當培養(yǎng)基蔗糖濃度過低時，花粉細胞吸脹并使花粉壁破裂，內(nèi)容物析出，花粉失活；而當外界環(huán)境滲透壓過高時，花粉細胞產(chǎn)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，花粉萌發(fā)同樣會受到抑制[16]。本研究顯示，15%蔗糖處理鐵甲秋海棠花粉無法正常萌發(fā)，可能是由于蔗糖濃度太高而導致花粉細胞失水死亡，萌發(fā)率為零[3,17]。鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的最適蔗糖濃度為5%，這與黃山玉蘭Yulaniacylindrica、大麗花Dahliapinnata花粉萌發(fā)所需的蔗糖濃度基本一致[18—19]。

研究表明，硼對花粉萌發(fā)和花粉管生長有促進作用，其對花粉管的生長作用可能是由于：一方面，硼可以促進糖-硼酸鹽復合物的形成以及增加氧的吸收；另一方面，由于硼是合成花粉管所必需的細胞壁的果膠成分[15，20]。大部分的硼存在于細胞壁中，會與果膠類物質(zhì)結(jié)合，使酸性果膠變成酯化果膠[21]。酸性果膠使細胞壁有足夠的機械強度，遍布于整個花粉管，而集中在花粉管頂端的酯化果膠則會促進花粉管的延伸；從而促進花粉管生長[21]。因此，添加適量的硼有利于花粉萌發(fā)。在胡迎峰等[18]的研究中，黃山玉蘭花粉萌發(fā)的最佳硼濃度是0.01%，這與本研究結(jié)果一致。

作為高分子滲透劑，PEG 可通過提高細胞膜透性及柔軟度，促進細胞對糖的吸收[2,22]。段青等[19]研究發(fā)現(xiàn)，2.5% PEG-4000 最適合大麗花花粉萌發(fā)。陳奇等[23]認為5% PEG-6000 最適合白菜型油菜Brassicarapa花粉離體萌發(fā)。而楊延紅等[24]也認為最適合‘紅寶石’海棠Malusspetabilis‘Royalty’花粉的萌發(fā)和花粉管生長的PEG-6000 濃度為5%。鐵甲秋海棠花粉萌發(fā)的最適PEG-4000 濃度亦為5%，與前人研究結(jié)果基本一致。

鈣離子作為植物代謝的重要調(diào)控因子，通常累積在花粉管尖端，其含量的波動對引導花粉萌發(fā)及花粉管生長有重要作用[3,15]。當內(nèi)源鈣離子不足時，添加一定濃度的外源鈣離子可以促進花粉萌發(fā)，但當內(nèi)源鈣離子充足時，高濃度外源鈣離子反而會抑制花粉萌發(fā)[15]。與之類似，低濃度(0.003%～0.010%)氯化鈣可促進鐵甲秋海棠的花粉萌發(fā)。鐵甲秋海棠花粉管生長的最佳氯化鈣濃度為0.003%；當濃度達0.005%時，花粉管生長受到抑制。值得注意的是，在未添加鈣離子的處理中，鐵甲秋海棠的萌發(fā)率高于其他物種花粉萌發(fā)率，達85.57%，花粉管長度達407.04 μm，這與前人的研究存在差異[15]。

不同植物花粉離體培養(yǎng)的最佳觀察時間存在差異。連翹Forsythiasuspensa花粉萌發(fā)的最佳觀察時間為培養(yǎng)3 h[15]；野杏Armeniacavulgarisvar.ansu花粉萌發(fā)最佳觀察時間為培養(yǎng)6 h[25]。鐵甲秋海棠花粉開始萌動時間為培養(yǎng)30 min；培養(yǎng)120 min 時，萌發(fā)率最高，狀態(tài)最佳；當培養(yǎng)140 min 時，花粉管長度偏長，會導致花粉在培養(yǎng)基中聚集成團，不易分散，從而影響觀測效果。因此，鐵甲秋海棠花粉離體培養(yǎng)最佳觀察時間為120 min。

綜上所述，鐵甲秋海棠花粉離體萌發(fā)適宜培養(yǎng)基為5%蔗糖+ 0.01%硼酸+ 5% PEG+ 0.003%氯化鈣，最佳觀察時間為培養(yǎng)120 min。