王俊芳，姜?jiǎng)P凱，楊東岳，孫玉霞，管雪強(qiáng)*

（山東省葡萄研究院/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，山東濟(jì)南 250100）

芪類(lèi)化合物是一類(lèi)多酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，屬于植物抗毒素，存在于包括葡萄在內(nèi)的部分植物中[1-2]。而其中的白藜蘆醇（Resveratrol，Res）具有醫(yī)學(xué)保健作用，可預(yù)防和減緩癌癥、心腦血管疾病的發(fā)生[3-4]。葡萄及其產(chǎn)品被認(rèn)為是食品中Res的重要來(lái)源，但是在大量栽培的葡萄果實(shí)中Res含量很低（<10 μg?g-1），因此，研究葡萄中Res的合成與積累及其調(diào)控機(jī)制，提高成熟果實(shí)中Res含量具有重要意義。

Res在葡萄果實(shí)中主要有4種存在形式：反式-白藜蘆醇（trans-resveratrol，trans-res）、順式-白藜蘆醇（cis-resveratrol，cis-res）、反式-白藜蘆醇苷（trans-piceid，trans-pd）、順式-白藜蘆醇苷（cispiceid，cis-pd）[5]。通常情況下，Res在不同組織器官和不同基因型葡萄品種中含量不同[6-7]。很多研究均表明，葡萄果實(shí)中Res的合成與積累從葡萄的轉(zhuǎn)色期（veraison，即果實(shí)開(kāi)始進(jìn)入成熟階段，著色品種開(kāi)始著色，白色品種果皮綠色減退、變淺、變黃，果肉開(kāi)始變軟）迅速增加，且與葡萄的成熟過(guò)程及果實(shí)中植物激素的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)[8-11]。

葡萄果實(shí)的成熟受植物激素的調(diào)控，包括脫落酸（Abscisic acid, ABA）、油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroids,BR）、乙烯（Ethylene, ETH）等[12-15]。在葡萄發(fā)育過(guò)程中，ABA的合成與積累出現(xiàn)在果實(shí)的始熟期或略早[16-18]。大量的研究表明，ABA在調(diào)控葡萄果實(shí)成熟過(guò)程中起著十分重要的作用，包括促進(jìn)果實(shí)著色、糖分積累和果實(shí)變軟等[12,16,19-24]，而施用ABA合成抑制劑氟啶酮（fluridone）可以抑制葡萄果實(shí)著色，延遲果實(shí)成熟[11,25]。

本研究采用外源ABA及其合成抑制劑處理‘品麗珠’葡萄果實(shí)，探討果實(shí)發(fā)育及成熟過(guò)程中Res合成與積累的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并通過(guò)分析果實(shí)中ABA的含量，進(jìn)一步探討ABA調(diào)控葡萄果實(shí)Res合成與積累機(jī)制，對(duì)研究外源誘導(dǎo)子調(diào)控葡萄果實(shí)Res的合成具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

(+)-脫落酸（ABA）（分析純，純度≥98%）購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司，氟啶酮（Fluridone，分析純）購(gòu)于Sigma-Adrich公司（美國(guó)）。

配制方法：稱(chēng)取一定量的(+)-ABA，先用少量的乙醇（0.1%，Vol，分析純）溶解，然后加水充分震蕩使其完全溶解，定容到一定體積，使其濃度為500 mg?L-1。然后在溶液中加入一定體積的表面附著劑Tween 80，其體積占最終溶液總體積的0.1%；氟啶酮溶液配制方法同上；對(duì)照（CK）的去離子水中也加入相同比例的乙醇和Tween 80。

以中糧集團(tuán)（蓬萊）釀酒試驗(yàn)基地的釀酒葡萄品種‘品麗珠’為試材，單干雙臂整形，南北行向，株行距為1 m×2.5 m，其他田間管理按常規(guī)。

1.2 處理方法

于2018年7月27日，即在‘品麗珠’果實(shí)的花后60 d（始熟期前10 d左右），選取72個(gè)果穗，在前期研究的基礎(chǔ)上，分別用500 mg?L-1的(+)-ABA、氟啶酮溶液進(jìn)行噴施直至溶液剛開(kāi)始下滴，每種溶液均處理24穗果；同時(shí)用去離子水浸泡處理的果穗作為對(duì)照。

1.3 取樣時(shí)間及方法

花后60 d（處理前）、花后61 d（處理后1 d）、花后62 d（處理后2 d）、花后67 d（處理后7 d）、花后81 d（處理后21 d）、花后95 d（處理后35 d）、花后116 d（處理后56 d）、花后138 d（處理后78 d，成熟期）取樣。

每次取3穗果，每穗果作為一個(gè)重復(fù)，樣品先用自來(lái)水沖洗，再用去離子水沖洗（去除果實(shí)表面外源ABA及氟啶酮溶液的殘留），吸水紙吸干表面，分離果實(shí)的果皮、果肉和種子，液氮速凍，研磨，-80 ℃冰箱下保存。

1.4 Res的提取與檢測(cè)分析

Res的提取參照Wang等[10]的方法：稱(chēng)取1 g果皮粉末，用10 mL甲醇和乙酸乙酯50∶50（Vol）的浸提液提取，25 ℃ 條件下避光浸提24 h 。然后在4 ℃、10 000 r?min-1下離心10 min，取上清液。再用3 mL浸提液重復(fù)提取，離心，取上清液。合并兩次上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃下旋蒸至干，用2 mL甲醇復(fù)溶，-40 ℃儲(chǔ)存，待測(cè)。

Res的檢測(cè)與分析參照Wang等[10]的方法。樣品均采用安捷倫高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。樣品上機(jī)分析前用0.22 μm PTFE膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）過(guò)濾。色譜柱為Atlantis?T3反相C18柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm, Waters，USA），保護(hù)柱為Atlantis T3（4.6 mm×20 mm，5.0 μm，Waters，USA)。

高效液相色譜的測(cè)定條件參照Wang等[10]。采用外標(biāo)法定量，標(biāo)樣trans-res和trans-pd可以在紫外線-C（UV-C）輻射處理下部分轉(zhuǎn)化為順式異構(gòu)體，所以兩種順式異構(gòu)體（cis-res和cis-pd）是通過(guò)UV-C輻射處理30 min后得到的，且兩種順式異構(gòu)體的含量是假設(shè)反式異構(gòu)體能夠百分之百轉(zhuǎn)化而計(jì)算，根據(jù)轉(zhuǎn)化率，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于本研究中主要測(cè)定trans-res、cisres、trans-pd和cis-pd的含量，因此，把上述4種物質(zhì)的總和計(jì)為Res總量。

1.5 基因表達(dá)分析

1.5.1 葡萄果皮RNA的提取

利用通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型，購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取果皮RNA。具體操作如下：

取100 mg葡萄果皮于液氮中快速研磨，將勻漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL RNase free離心管中，加入1 mL的裂解液PL，在65 ℃條件下孵育5 min。然后在4 ℃條件下，以12 000 r?min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，轉(zhuǎn)入新的RNase free過(guò)濾柱中。以10 000 r?min-1轉(zhuǎn)速離心45 s。收集濾液（含有總RNA）于收集管中，加入1倍體積70%乙醇，充分顛倒混勻，將得到的溶液轉(zhuǎn)入吸附柱中。以10 000 r?min-1轉(zhuǎn)速離心45 s，加入500 μL的去蛋白液，以12 000 r?min-1轉(zhuǎn)速離心45 s。加入700 μL漂洗液，以12 000 r?min-1轉(zhuǎn)速離心60 s，棄掉廢液。再加入500 μL漂洗液RW，以12 000 r?min-1轉(zhuǎn)速離心60 s，棄掉廢液。將吸附柱放回空收集管中，以12 000 r?min-1轉(zhuǎn)速離心2 min，盡量除去漂洗液。取出吸附柱，放入一個(gè)新的RNase free離心管中，在吸附膜的中間部位加45 μL RNase free water，室溫放置2 min，以12 000 r?min-1轉(zhuǎn)速離心1 min，即獲得了RNA提取物，置于-80 ℃保存。

1.5.2 DNA消化及反轉(zhuǎn)錄過(guò)程

利用天根生化科技（北京）有限公司的快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fast quant RT with gDNase KR106，中國(guó)）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體操作如下：

將模板RNA在冰上解凍，5×DNA Buffer、FQRT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室溫（15～25 ℃）解凍，然后置于冰上，使用前震蕩搖勻，收集殘留管壁的液體。

DNA的消化：在無(wú)核酸酶的離心管中，將13 μL總RNA和2 μL 5×gDNA Buあer配制成反應(yīng)液，共15 μL，混勻，然后42 ℃下反應(yīng)3 min。

反轉(zhuǎn)錄過(guò)程：在無(wú)核酸酶的離心管中，將2 μL的10×Fast RT Buffer、1 μL的RT Enzyme Mix和2 μL的FQ-RT Primer MIX配制成反應(yīng)液，并將5 μL該反應(yīng)液加入到DNA消化過(guò)程中的15 μL液體中，總反應(yīng)體積為20 μL，然后先在42 ℃下反應(yīng)15 min，再在95 ℃下反應(yīng)3 min，即得到cDNA，在-20 ℃保存，備用。

1.5.3 引物的合成

引物序列參照作者及前人[9,14]已發(fā)表文章中所用的引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 Res及ABA合成及調(diào)控相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primers of genes related to Res and ABA biosynthesis and regulation

1.5.4 熒光定量PCR

使用天根生化科技有限公司的RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。先將20×SYBR Solution和2.5×RealMasterMix在冰上解凍，然后將125 μL 20×SYBR Solution加入至2.5×RealMasterMix中，徹底混勻。在PCR反應(yīng)管中配制20 μL的反應(yīng)體系：9 μL 2.5×RealMasterMix/SYBR Solution、0.6 μL/0.6 μL的正反向引物、1 μL的DNA模板、8.8 μL的超純水。

使用7500熒光定量PCR儀進(jìn)行以下程序：先在94 ℃預(yù)變性2 min；按以下程序進(jìn)行40個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增：94 ℃變性10 s，58 ℃退火18 s，68 ℃延伸30 s；然后按照以下梯度采集溶解曲線：95 ℃保持1 min，55 ℃保持30 s，95 ℃保持30 s結(jié)束整個(gè)程序，熒光定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)葡萄樣品3次重復(fù)的平均值被用來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析，采用PASW Statistics 13.0（SPSS，USA）處理數(shù)據(jù)，不同發(fā)育時(shí)期之間用One-Way ANONA 進(jìn)行方差分析，所有圖表用Sigma Plot 12.5制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)果實(shí)粒質(zhì)量及可溶性固形物含量影響

從圖1可以看出，所有處理的粒質(zhì)量均表現(xiàn)為前期快速增大，在花后80 d以后趨于平穩(wěn)的狀態(tài)。在138 d，ABA處理的粒質(zhì)量比對(duì)照增加約11%，而ABA合成抑制劑氟啶酮處理的粒質(zhì)量低于對(duì)照。在可溶性固形物含量方面，在成熟過(guò)程中3個(gè)處理均呈不斷上升趨勢(shì)，在花后116 d所有處理基本相同，但此后表現(xiàn)不同，ABA處理和對(duì)照繼續(xù)增加，在花后138 d達(dá)到最大值；氟啶酮處理則不再增加，顯著低于對(duì)照約20%。

圖1 不同處理對(duì)‘品麗珠’發(fā)育過(guò)程中果實(shí)粒質(zhì)量（A）及可溶性固形物（B）的影響Figure 1 Berry weight(A) and total soluble solids (B) over the growing season in 'Cabernet France' berries

2.2 不同處理對(duì)果實(shí)內(nèi)源ABA含量及其相關(guān)基因表達(dá)的影響

外源ABA處理‘品麗珠’葡萄果實(shí)后，顯著增加了果實(shí)中內(nèi)源ABA的含量，且在果實(shí)整個(gè)成熟過(guò)程中，ABA的含量均高于對(duì)照（圖2），尤其是在花后62 d達(dá)到高峰（約0.7 μg?g-1）；氟啶酮處理后降低了果實(shí)中內(nèi)源ABA的含量，但其變化趨勢(shì)與對(duì)照一致。

圖2 不同處理下‘品麗珠’果實(shí)發(fā)育過(guò)程中ABA含量變化Figure 2 Changes of ABA content in the development of'Cabernet Franc' berries under diあerent treatments

外源ABA處理后，ABA的兩個(gè)合成基因VvNCED1和VvNCED2的表達(dá)在前期升高（圖3），VvNCED1在花后62 d和67 d時(shí)顯著高于對(duì)照，并在花后67 d出現(xiàn)表達(dá)高峰，但是在花后116 d，出現(xiàn)第二個(gè)表達(dá)高峰，顯著低于對(duì)照；而VvNCED2在ABA處理后前期顯著高于對(duì)照，在花后81 d出現(xiàn)表達(dá)高峰，花后95 d低于對(duì)照。而氟啶酮處理后，VvNCED1的表達(dá)在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，在處理前期和后期，果實(shí)中VvNCED1的表達(dá)都低于對(duì)照，但在花后95 d高于對(duì)照（圖3A）；而VvNCED2表達(dá)在氟啶酮處理后顯著受到抑制（圖3B）。

圖3 不同處理對(duì)葡萄果實(shí)中ABA合成基因表達(dá)的影響Figure 3 Eあects of diあerent treatments on ABA synthesis gene expression in grape fruits

2.3 不同處理對(duì)總Res含量及其組分的影響

如圖4所示，在‘品麗珠’葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，總Res含量持續(xù)增加，從花后81 d開(kāi)始直到成熟，ABA處理的葡萄果實(shí)中總Res含量均顯著高于對(duì)照；用氟啶酮處理后，總Res含量積累減慢，并顯著低于對(duì)照。由圖5可以看出，‘品麗珠’果實(shí)總Res主要是由trans-res和cis-pd組成，約占53%和38%（圖5B，C），且二者含量在外源ABA處理后顯著增加；氟啶酮處理后，trans-res在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中變化不明顯，只有在花后81 d和成熟期顯著低于對(duì)照（圖5B），但是cis-pd顯著降低（圖5C）；而trans-pd和cis-res含量較低，在ABA及氟啶酮處理后變化較?。▓D5A，D），但在花后116 d和成熟期的ABA處理葡萄果實(shí)中trans-pd顯著高于對(duì)照，而花后95 d的果實(shí)中cis-res含量顯著高于對(duì)照。

圖4 不同處理對(duì)‘品麗珠’發(fā)育過(guò)程中總Res含量的影響Figure 4 Eあects of diあerent treatments ontotal Res content duringdevelopment of 'Cabernet Franc' berries

圖5 不同處理對(duì)‘品麗珠’發(fā)育過(guò)程中Res各組分含量的影響Figure 5 Eあects of diあerent treatments on the content of Res components during development of 'Cabernet Franc' berries

2.4 不同處理對(duì)Res合成基因表達(dá)的影響

外源ABA處理后的前期，苯丙氨酸代謝途徑的第一個(gè)基因VvPAL表達(dá)沒(méi)有變化，但在成熟期顯著高于對(duì)照，而在花后67 d的氟啶酮處理葡萄果實(shí)中顯著低于對(duì)照（圖6A）；VvC4H在花后67 d和138 d的ABA處理葡萄果實(shí)中顯著高于對(duì)照，而氟啶酮處理后幾乎沒(méi)有變化（圖6B）；Vv4CL在花后67 d和81 d 的ABA處理后葡萄果實(shí)中表達(dá)顯著低于對(duì)照，但在成熟期高于對(duì)照，而花后67 d、81 d、95 d的氟啶酮處理后葡萄果實(shí)中顯著低于對(duì)照（圖6C）。

圖6 不同處理對(duì)‘品麗珠’發(fā)育過(guò)程中Res合成相關(guān)基因表達(dá)的影響 (續(xù)）Figure 6 Eあects of diあerent treatments on the expression of genes related to Res synthesis during development of 'Cabernet Franc' berries

圖6 不同處理對(duì)‘品麗珠’發(fā)育過(guò)程中Res合成相關(guān)基因表達(dá)的影響Figure 6 Eあects of diあerent treatments on the expression of genes related to Res synthesis duringdevelopment of 'Cabernet Franc' berries

在‘品麗珠’葡萄果實(shí)花后60 d用ABA處理發(fā)現(xiàn)，在花后81 d，VvSTS表達(dá)顯著高于對(duì)照，在花后95 d，ABA處理和對(duì)照果實(shí)中VvSTS的表達(dá)都達(dá)到最高，但無(wú)顯著性差異；隨后表達(dá)量降低，在成熟期略有增加（圖6D）；VvSTS的一個(gè)重要調(diào)節(jié)基因VvMyb14在花后67 d的ABA處理葡萄果實(shí)中顯著高于對(duì)照，隨后其表達(dá)趨勢(shì)和對(duì)照基本一致，但無(wú)顯著性差異（圖6E）；VvSTS的另一個(gè)重要調(diào)節(jié)基因VvMyb15在外源ABA處理后的果實(shí)成熟過(guò)程中基本無(wú)變化，但是在成熟期顯著高于對(duì)照（圖6F）；Res糖苷合成的關(guān)鍵基因VvO3GT在花后95 d的ABA處理果實(shí)中與對(duì)照同時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，并顯著高于對(duì)照，隨后降低（圖6G）。

而ABA合成抑制劑處理后，VvSTS、VvMyb14、VvMyb15及VvO3GT的表達(dá)量均或多或少的降低，且在整個(gè)果實(shí)成熟過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)表達(dá)高峰。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，外源ABA處理能夠促進(jìn)‘品麗珠’葡萄果實(shí)提前成熟，果實(shí)中內(nèi)源ABA含量增加，且ABA處理后果實(shí)中Res含量增加。氟啶酮處理則抑制了葡萄果實(shí)成熟，且果實(shí)中Res含量降低。葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中Res合成受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，外源ABA處理后ABA合成基因VvNCED1和VvNCED2表達(dá)升高，Res合成相關(guān)基因及其調(diào)控基因（尤其是VvSTS、VvMyb14及VvMyb15）表達(dá)升高，而氟啶酮處理后表達(dá)量降低。

眾多研究表明，外源ABA的施加，能夠增加果實(shí)著色，加速果實(shí)成熟，即ABA在果實(shí)成熟過(guò)程中起著重要作用。在本研究中，外源ABA施用后，內(nèi)源ABA的含量增加，有可能是因?yàn)橥庠碅BA進(jìn)入果實(shí)內(nèi)部造成的；然而ABA合成基因VvNCED1和VvNCED2表達(dá)升高，表明是由于外源ABA的刺激，導(dǎo)致內(nèi)源ABA的合成增加[26]。同時(shí)表明由于外源ABA的施用先啟動(dòng)內(nèi)源ABA的合成與積累，當(dāng)內(nèi)源ABA的含量積累到一定程度之后，再啟動(dòng)葡萄果實(shí)的成熟，即促使‘品麗珠’葡萄提前進(jìn)入始熟期，進(jìn)而啟動(dòng)Res的合成與積累。

在ABA信號(hào)途徑中，ABEB/ABFs是bZIP（basic leucine zipper）家族Group A中可以結(jié)合在ABA-響應(yīng)元件上的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要作用[27-28]。VvABF2是一個(gè)與葡萄果實(shí)成熟相關(guān)且在細(xì)胞核中表達(dá)的ABEB/ABF-like轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與下游基因啟動(dòng)子上特定序列結(jié)合，激活下游基因表達(dá)；當(dāng)VvABF2過(guò)表達(dá)時(shí)，受ABA調(diào)控的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族成員（DREB、WRKY和MYB等）上調(diào)；同時(shí)在VvABF2過(guò)表達(dá)的葡萄細(xì)胞懸浮系中Res含量增加，且ABA處理能夠增強(qiáng)此作用[18]。因此本試驗(yàn)對(duì)將來(lái)研究ABA信號(hào)途徑調(diào)控Res的合成與積累具有重要意義。

綜上所述，在葡萄生產(chǎn)上可利用相應(yīng)的栽培措施促進(jìn)植物體內(nèi)ABA積累增加，調(diào)控葡萄果實(shí)的成熟[29]，進(jìn)而調(diào)控葡萄果實(shí)中Res的合成與積累，有利于促進(jìn)果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的增加。