蔡 凌,魏盟想,賀黎銘,謝 欣,羅 舒,李 芳,羅 霞

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院/菌類藥材系統(tǒng)研究與開發(fā)實驗室/中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室,成都 610041)

藥用真菌包括屬子囊菌綱的冬蟲夏草、蟬花、竹黃等,以形成子囊孢子的方式來繁殖,和屬擔(dān)子菌綱的馬勃、茯苓、靈芝、豬苓、雷丸等,以形成擔(dān)孢子的方式來繁殖。目前實際科研和生產(chǎn)中,幾乎所有藥用真菌種質(zhì)資源在保藏過程中都面臨著不同程度的退化,如何保證菌種質(zhì)量是當今急需解決的關(guān)鍵問題。

1 退化現(xiàn)象

藥用真菌菌種退化最直觀的表現(xiàn)為某些優(yōu)良性狀的劣化,它發(fā)生在菌種培養(yǎng)、保存的各個時期,具體表現(xiàn)為菌絲體生長速度變緩,長勢變?nèi)?菌絲變干變癟,甚至發(fā)生自溶現(xiàn)象;菌落變稀變薄,呈扇形或者角狀,出現(xiàn)假色素積累或假拮抗反應(yīng);菌種生長能力下降,原基數(shù)量變少,子實體變小,影響產(chǎn)量、品質(zhì),甚至不產(chǎn)子實體等。王殿振等[1]發(fā)現(xiàn)北蟲草菌種在液體菌種培養(yǎng)過程中,菌齡過大會會發(fā)生菌絲體自溶現(xiàn)象。孟小麗等[2]發(fā)現(xiàn)鏡檢蛹蟲草正常菌絲較為粗壯挺立、分生孢子為念珠狀,退化菌絲則比較纖細彎曲,分生孢子呈頭狀或山丘狀。胡中娥等[3]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌種傳代超過3次,出現(xiàn)菌絲生長速度下降,見光轉(zhuǎn)色能力變差,子實體的產(chǎn)量明顯下降甚至不產(chǎn)子實體。

2 影響退化因素

2.1 遺傳學(xué)和細胞學(xué)原因

菌種退化的本質(zhì)是染色體的變異,主要由于基因突變引起[4]。李美娜等[5]研究發(fā)現(xiàn)退化蛹蟲草菌種和正常菌種有不少于2個位點的差異,第279和第360個堿基處發(fā)生了T到C堿基突變。何曉紅等[6]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草退化因為其核型發(fā)生改變、基因存在突變、胞內(nèi)有害物質(zhì)出現(xiàn)積累和病毒的入侵等。汪虹等[7]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草正常菌株為異核體而退化現(xiàn)象菌株為同核體,發(fā)生不形成子實體的菌種退化現(xiàn)象的原因之一是核相發(fā)生改變。

2.2 環(huán)境因素

影響藥用真菌菌種質(zhì)量的環(huán)境因素及相應(yīng)的解決措施有諸多報道,菌種培養(yǎng)或保藏時的養(yǎng)分、溫濕度、氧氣含量、轉(zhuǎn)管次數(shù)、保藏時間、都將影響菌種質(zhì)量[8-13]。培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分過于豐富或過于貧瘠都將引起菌種退化。胡秀彩[14]等研究發(fā)現(xiàn)菌種的退化與培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)接次數(shù)有很大關(guān)系。孟小麗等[2]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌種保藏時間過長或保藏溫度不當均可引起菌種退化,傳代次數(shù)多的菌種甚至出現(xiàn)菌絲長速度緩慢,子實體轉(zhuǎn)色能力差,產(chǎn)量下降等。

3 保藏方法

菌種的常用保藏方法有斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、菌絲液體保藏法、木屑、木塊、枝條保藏法、液氮超低溫保藏等。原理是根據(jù)菌種特性,創(chuàng)造缺氧、低溫或干燥的環(huán)境,降低微生物代謝水平,使其休眠或生命活動基本停滯,保有更加穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)。

3.1 斜面低溫保藏法

斜面低溫保藏法是將菌種接種在具橡膠塞的斜面培養(yǎng)基上,待菌絲長滿斜面時,置于4℃的冰箱保藏。因為菌種還在繼續(xù)生長,試管內(nèi)培養(yǎng)基易失水變干,需要每隔6個月轉(zhuǎn)管1次,因此,保藏時間較短,轉(zhuǎn)管次數(shù)較多,不適于長期保藏。郭玲玲[15]發(fā)現(xiàn)經(jīng)常更換培養(yǎng)基配方可防止同一菌種長期使用同一培養(yǎng)基,因某些酶和活性物質(zhì)長期得不到啟用而鈍化或喪失活力,出現(xiàn)菌絲生長速度會減慢現(xiàn)象。

3.2 液體石蠟保藏法

液體石蠟保藏法是在斜面低溫保藏法基礎(chǔ)上加入液體石蠟防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā),隔絕菌絲和空氣接觸,使菌種處于休眠狀態(tài),保持菌種優(yōu)良種性。一般可保藏3～5年,是一種中長期的菌種保藏方法。李鐘慶等[16]用礦油保藏的44屬63種181株菌株中紫芝、靈芝、茯苓,保藏5～7年全部存活,第8年時僅紫芝失活,栽培試驗發(fā)現(xiàn)礦物油封藏后均能形成子實體。

3.3 菌絲液體保藏法

菌絲液體保藏法是將液體培養(yǎng)的菌絲球保藏在生理鹽水或者營養(yǎng)液中的一種方法。王明霞[17]綜述提到據(jù)黑龍江應(yīng)用微生物研究所菌種保藏研究室報道,紫靈芝菌種菌絲體生理鹽水保藏可存活1.5年。劉風(fēng)春等[18]用營養(yǎng)液保存36株擔(dān)子菌中紫芝、靈芝、茯苓菌絲球保存33個月和42個月后全部存活,菌種塊僅紫芝42個月時失活,其余全部存活,較生理鹽水保藏表現(xiàn)優(yōu)異。

3.4 木屑、木塊、枝條保藏法

木屑、木塊、枝條保藏法是指在試管中加入一定比列的木屑、木塊、枝條等培養(yǎng)基料待菌絲體滿管后進行低溫保藏的一種方式。劉風(fēng)春等[19]將雜有小木片的木屑加水拌勻,或在木屑中加入營養(yǎng)物質(zhì),均獲得較好的保藏效果。戴肖東等[20]用木屑保藏法保藏靈芝菌種7年后仍然保持很好活性。邵晨霞等[21]發(fā)現(xiàn)木屑管保藏法適用于茯苓的長期保藏。

3.5 液氮超低溫保藏法

液氮超過低溫保藏法是將菌種和保護劑一起裝入安瓿瓶內(nèi),再放入液氮(-196℃)中或隔氮超低溫環(huán)境中(-135℃左右)進行保藏,由于菌種處于超低溫環(huán)境,其代謝降低到完全停止的狀態(tài),是目前菌種長期保藏最有效、最可靠的方法。Morris等[22]發(fā)現(xiàn)快速冷凍對大部分擔(dān)子菌、結(jié)合菌和子囊菌,菌絲體內(nèi)的細胞影響較小。Homolka等[23-24]使用珍珠巖作為載體與常規(guī)瓊脂為載體進行液氮保藏的效果比較具有絕對優(yōu)勢。Hubalek[25]認為保護劑效果較好的是二甲基亞砜、甲醇、乙二醇、丙二醇等。顧金剛等[26]表明降溫方式、解凍方式、保護劑是液氮超低溫保藏技術(shù)的3個關(guān)鍵因素。王華等[27]研究發(fā)現(xiàn)冰晶的形成、滲透壓、保護劑毒性給細胞造成多種脅迫并對細胞有一定的損害。謝航等[28]優(yōu)化靈芝菌種的液氮保藏工藝,分析降溫程序、培養(yǎng)基、菌餅大小、甘油濃度和解凍方式等方面對菌種保藏的影響。

3.6 其他保藏方法

生產(chǎn)中常常會用到普通冰箱對菌種進行暫時保藏,王曉敏等[29]研究發(fā)現(xiàn)保護劑含量是影響-20℃低溫保藏靈芝菌株活性的關(guān)鍵因素,最優(yōu)保護劑配方為蔗糖5.8%、甲醇8%、丙三醇4.7%。貴州農(nóng)學(xué)院了文奇曾用麥粒保藏靈芝也獲得良好效果。Voyron等[30]采用6種低溫保藏方法和12種凍干保藏方法進行對比,認為凍干保藏不適合靈芝屬真菌的保藏。

4 評價指標及檢測方法

菌種質(zhì)量的檢測主要包括菌種真實性、菌種活力、菌種純度、農(nóng)藝性狀等幾方面的主要內(nèi)容。菌種真實性是指名稱與栽培性狀是否一致[31]。陳世林等[32]應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)基于ITS序列建立了靈芝DNA條形碼,應(yīng)用效果顯著,得到了廣泛的認可。目前黑龍江、山東、四川、天津等省市出臺了靈芝菌種的地方標準[33-37],從菌種直觀形態(tài)包括:菌株的成活率、接種物存活率、菌絲、菌落形態(tài)、產(chǎn)菇能力、子實體性狀、生物學(xué)效率等進行規(guī)范。但這些檢測指標對于表觀現(xiàn)象不明顯的菌種活力減弱的預(yù)判性差。結(jié)實性試驗周期長,屬于事后評價,不能進行預(yù)判,具有明顯的缺陷。研究者們通常采用生理生化檢測手段,來獲得可以量化的菌絲體代謝數(shù)據(jù),評價菌種活力。微觀生理活性指標包括:相關(guān)酶活的測定(纖維素酶、漆酶等)、酯酶同工酶譜和可溶性蛋白帶的變化、DAN檢測、發(fā)酵產(chǎn)物的變化(蟲草素、蟲草多糖、多糖等)等[8, 24-25, 30,38-39]。

4.1 相關(guān)酶活的測定

脫氫酶的活性可反應(yīng)細胞活性強弱,漆酶可以選擇性降解栽培料中木質(zhì)素,纖維素酶可分解其中植物纖維,已經(jīng)成為菌種活力強弱的檢驗指標。劉淑琴等[40]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草液體菌種脫氫酶含量和其子實體的產(chǎn)量成正比。林清泉等[41]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草正常菌株的脫氫酶活性高于退化菌株。黃春花等[42]優(yōu)化的蛹蟲草TTC-脫氫酶活性檢測方法,使得測定結(jié)果重現(xiàn)性好、準確度高、操作更簡便。暴增海[43]等提出纖維分解酶活性增加與子實體生理生化關(guān)系密切。

4.2 DAN檢測

隨著分子技術(shù)及測序技術(shù)的發(fā)展,藥用真菌種質(zhì)資源的鑒定評價從早期的表型性狀鑒定發(fā)展到分子水平的基因型鑒定。李美娜等[5]應(yīng)用RFLP和RAPD兩種分子標記技術(shù)獲得了關(guān)于正常菌株和退化菌株之間DNA水平的差異。馮德龍等[44]基于交配型基因分子標記研究了優(yōu)良性狀蛹蟲草野生菌W141436 的退化機制。

5 復(fù)壯方法

5.1 組織分離復(fù)壯技術(shù)

組織分離復(fù)壯技術(shù)操作簡便易學(xué),能夠保持菌株的優(yōu)良性狀。耿向勇等[45]采用組織分離技術(shù)分離西藏野生靈芝,最終獲得具有出菇能力強的的靈芝菌株。諸發(fā)會[46]采用組織分離方法分離茯苓菌株,并進行菌絲形態(tài)及熒光核染色顯微觀察。胡中娥等[47]發(fā)現(xiàn)北冬蟲夏草經(jīng)過組織分離加復(fù)壯處理后,菌絲活力提高,鮮草產(chǎn)量明顯提高。方華舟[48]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草采用組織分離方法獲得優(yōu)良菌種率高于孢子培養(yǎng)方法,且更有利于保持母本性狀。

5.2 尖端分離技術(shù)

菌種的生長繁殖是由于尖端菌絲的不斷生長伸長、分支扭結(jié)而形成菌絲體。尖端菌絲的活力、純度等都具有一定優(yōu)勢,挑取健壯菌絲體頂端部分,進行純化培養(yǎng),可保持菌種的純度,恢復(fù)原來的生活力和優(yōu)良種性,達到復(fù)壯的目的。黃曉潤等[49]采用尖端分離技術(shù)分離紅托竹蓀菌種,3株復(fù)壯菌株長勢濃密。孫彥平等[50]對滑子菇菌種退化嚴重品種,通過尖端分離技術(shù)進行提純復(fù)壯,篩選出菌絲長勢一致的且均一的菌種。

5.3 原生質(zhì)體再生技術(shù)

菌種細胞在混合酶的作用下裂解細胞壁,形成的原生質(zhì)球同樣具有再生能力。熊歡[51]利用原生質(zhì)體技術(shù)復(fù)壯茯苓菌株,獲得高于出發(fā)菌株產(chǎn)量的復(fù)壯菌株。李云夢[52]發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體分離技術(shù)較組織分離、尖端分離分離的菌株菌絲長速、漆酶活性、第一潮菇產(chǎn)量高。藥用真菌種是否存在相同情況,目前暫無相關(guān)研究證明。

5.4 其他分離方法

除無性繁殖復(fù)壯外,還采用有性孢子分離和篩選。夏淑春等[53]采用基內(nèi)菌絲分離法、子囊孢子分離法、分生孢子分離法等進行蛹蟲草菌種復(fù)壯,對比發(fā)現(xiàn)子囊孢子分離法和蠶蛹回接法復(fù)壯效果顯著優(yōu)于分生孢子分離法。王殿振等[54]采用蠶蛹回接法、組織分離復(fù)壯法、孢子分離法等進行北蟲草菌種復(fù)壯,對比發(fā)現(xiàn)蠶蛹回接法效果最佳。

6 展望

藥用真菌菌種質(zhì)量從退化機制,保藏方式,評價指標都有深入的研究,但不同種質(zhì)資源所適合的保持方式不同,同種保藏方式采取不同保藏工藝保藏效果不同,可進一步加強對保藏工藝的優(yōu)化和闡明保藏過程生理變化及分子機理。為科學(xué)、穩(wěn)定、高效地保藏菌種提供理論支持,最終解決菌種保藏中菌種退化的難題。再結(jié)合適宜不同藥用真菌的復(fù)壯方式,進一步確保菌種特性和優(yōu)良的產(chǎn)品性狀,保障消費者對優(yōu)質(zhì)菌類中藥材日益增長的需求。