蔣鴻雁,何 姣,王浩君,陳忠宜

(遂寧市中心醫(yī)院,四川 遂寧 629000)

結(jié)核病(TB)由結(jié)核分枝桿菌引起,通過(guò)呼吸道在人與人之間傳播,具有傳播速度快、傳播面廣、易感染的特點(diǎn)。結(jié)核分枝桿菌具有高致病性,常引起肺部感染,且淋巴結(jié)、腦、腎臟和脊柱也會(huì)受到侵襲[1]。最常見(jiàn)的檢查手段為影像學(xué)和免疫學(xué)檢查,但也有局限性,在鑒別肺部結(jié)核和感染性疾病方面較為困難,需取活組織進(jìn)行病理學(xué)檢查確診,而傳統(tǒng)病理診斷主要依靠鏡下形態(tài)和抗酸染色結(jié)果相結(jié)合,但抗酸染色陽(yáng)性率低、費(fèi)力、耗時(shí)[2],也逐漸被分子檢測(cè)所取代[3-5]。在分子檢測(cè)中,最常用的就是實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中,由于實(shí)驗(yàn)人員對(duì)切片數(shù)量、切片厚度的把控不同,導(dǎo)致了對(duì)切片量的控制不同,直接影響核酸的提取效率,影響樣本的濃度和純度,在一定程度上會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的效果。有學(xué)者[6]指出,高質(zhì)量的DNA是分子檢測(cè)的基礎(chǔ),而DNA的質(zhì)量一般從DNA的濃度、純度以及DNA的完整性三方面進(jìn)行評(píng)估。因此,本文著重探討規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量對(duì)RT-PCR檢測(cè)石蠟樣本結(jié)核DNA濃度和純度的影響,以提高樣本DNA的效用,確保結(jié)核病理診斷準(zhǔn)確性,為臨床和患者提供可靠診療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2022年11月—2023年5月遂寧市中心醫(yī)院病理科診斷為疑似結(jié)核的石蠟樣本組織216 例,根據(jù)診斷需要,切取一定量的石蠟樣本組織,用于RT-PCR檢測(cè),并記錄其DNA的濃度和純度。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)遂寧市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

醫(yī)脈賽核酸提取/純化試劑盒(嘉興醫(yī)脈賽科技有限公司,中國(guó)),結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒(天隆科技有限公司,中國(guó)),PCR儀(Roche,德國(guó)),核酸濃度檢測(cè)儀(艾德生物,中國(guó))以及實(shí)驗(yàn)用槍頭、Leica石蠟切片機(jī)、移液槍、PCR八聯(lián)管、試管架等耗材均由遂寧市中心醫(yī)院病理科提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 石蠟樣本組織的切片

規(guī)范前,根據(jù)實(shí)驗(yàn)人員對(duì)石蠟樣本組織的評(píng)估,對(duì)需要做結(jié)核DNA檢測(cè)的石蠟樣本大組織(見(jiàn)圖1a)進(jìn)行切片,切片厚度為4 μm,切片數(shù)量為10張;對(duì)石蠟樣本中等大小的組織(見(jiàn)圖1b)進(jìn)行切片,切片厚度為4 μm,切片數(shù)量為12張;對(duì)石蠟樣本小組織(見(jiàn)圖1c)進(jìn)行切片,切片厚度為4 μm,切片數(shù)量為15張。

(a)為大組織;(b)為中等大小組織;(c)為小組織

規(guī)范后,實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)前期摸索,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)需要做結(jié)核DNA檢測(cè)的石蠟樣本大組織(見(jiàn)圖1a和圖1b)進(jìn)行切片,切片厚度為6 μm,切片數(shù)量為4～6張;對(duì)中等大小的穿刺組織(見(jiàn)圖2)進(jìn)行切片,切片厚度為6 μm,切片數(shù)量為8～15張;對(duì)石蠟樣本小組織(見(jiàn)圖1c)進(jìn)行切片,切片厚度為6 μm,切片數(shù)量為15～20張。

圖2 石蠟樣本穿刺組織

1.3.2 核酸提取

參考醫(yī)脈賽核酸提取/純化試劑盒對(duì)石蠟樣本組織進(jìn)行DNA提取,詳細(xì)操作步驟如下。第一,樣本前處理:將切取的石蠟組織切片轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中;加入300 μL石蠟樣本液,150 μL石蠟消化液A和20 μL蛋白酶K,置于56 ℃恒溫金屬浴消化過(guò)夜;次日,將150 μL石蠟消化液B加入標(biāo)本管,充分混勻后,70 ℃恒溫金屬浴消化2 h。第二,DNA的提取:4 ℃,10 000 g離心10 min;離心后,小心吸取全部下層液體,加入300 μL裂解吸附液、20 μL核酸提取磁珠、10 μL核酸提取液顛倒混勻15 min;用磁分離架吸附磁珠1 min,棄上清;加入600 μL洗滌液Ⅰ洗滌磁珠,顛倒混勻洗滌1 min,吸附磁珠,棄上清;再次加入600 μL洗滌液Ⅱ洗滌磁珠1 min,吸附磁珠,棄上清;加入600 μL洗滌液Ⅲ洗滌磁珠1 min,吸附磁珠,棄上清;盡量吸棄上清后,靜置5 min,去除乙醇?xì)埩?加入50 μL洗脫液,50 ℃混合均勻洗脫10 min;磁場(chǎng)吸附磁珠,回收含基因組DNA的洗脫液至另一干凈離心管內(nèi),以備實(shí)驗(yàn)需要(-20 ℃儲(chǔ)存)。

通過(guò)核酸濃度檢測(cè)儀,對(duì)樣本進(jìn)行濃度和純度檢測(cè),參照操作說(shuō)明書(shū):用焦碳酸二乙酯(DEPC)水調(diào)零后,吸取2 μL待測(cè)DNA溶液滴在檢測(cè)探頭上,放下懸臂,檢測(cè)讀取A260/A280和DNA的濃度值。提起懸臂,用干凈衛(wèi)生紙除去DNA溶液,用DEPC水清洗,擦去DEPC水后檢測(cè)下一個(gè)樣本,并記錄詳細(xì)數(shù)值。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

參照試劑說(shuō)明書(shū),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,將提取到的DNA溶液取4 μL加入到36 μL的體系中按預(yù)設(shè)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增(40個(gè)循環(huán)),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集FAM通道熒光信號(hào),并記錄數(shù)據(jù)。

1.4 參考標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 DNA的濃度

不同檢測(cè)方法或檢測(cè)試劑盒對(duì)被檢查樣本的DNA濃度要求不盡相同。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)平臺(tái)的需要,認(rèn)為將DNA濃度控制在60.00～600.00 ng/μL比較好[6]。

1.4.2 DNA的純度

DNA的A260/A280的正常值為1.80～2.00[6]。

2 結(jié) 果

2.1 規(guī)范前后石蠟樣本組織的DNA濃度評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)每一個(gè)樣品進(jìn)行濃度檢測(cè),其中詳細(xì)記錄樣本濃度者216 例。本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量前后的DNA濃度發(fā)現(xiàn),規(guī)范切片前,樣本DNA濃度為2.25～1 373.00 ng/μL,平均濃度128.70 ng/μL。規(guī)范切片后,樣本DNA濃度范圍為6.20～1 380.00 ng/μL,DNA的濃度有所增加,平均濃度149.20 ng/μL,其濃度主要集中在20～200 ng/μL(見(jiàn)圖3)。對(duì)實(shí)驗(yàn)中兩次DNA濃度超過(guò)1 300.00 ng/μL的樣本均稀釋10倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 規(guī)范前和規(guī)范后石蠟樣本組織DNA濃度比較

2.2 規(guī)范前后石蠟樣本組織的DNA純度評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)每一個(gè)樣品進(jìn)行濃度檢測(cè)并記錄A260/A280的數(shù)值,其中詳細(xì)記錄樣本純度者216 例。DNA純度1.80～2.10為樣本純度較高,否則會(huì)存在一定的污染[6]。本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量前后的DNA純度發(fā)現(xiàn),規(guī)范切片前DNA純度范圍為1.10～2.20。規(guī)范切片后,DNA的純度有所改善,濃度主要集中在1.80～2.27(見(jiàn)圖4)。

圖4 規(guī)范前和規(guī)范后石蠟樣本組織DNA純度

本研究通過(guò)收集規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量前后的DNA濃度和純度,發(fā)現(xiàn)規(guī)范切片前,DNA濃度相對(duì)較低的樣本,其純度也較低,實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)抗酸染色和RT-PCR的符合率(數(shù)據(jù)待發(fā))發(fā)現(xiàn),均為陰性的符合率為40%,均為陽(yáng)性的符合率為23%。規(guī)范切片后,組織的DNA濃度有所增加,純度也較高,相對(duì)而言改善了樣本的質(zhì)量,實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)抗酸染色和RT-PCR的符合率(數(shù)據(jù)待發(fā)),均為陰性的符合率為44%,均為陽(yáng)性的符合率為25%,在一定程度上確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究出現(xiàn)的兩個(gè)石蠟樣本組織的濃度超過(guò)1 300 ng/μL,純度處于2.00～2.10,屬于質(zhì)量較好的樣本,根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需,我們稀釋了10倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果符合臨床癥狀,且與相關(guān)檢驗(yàn)/檢查相符合,滿(mǎn)足診斷需求。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原體。結(jié)核病發(fā)展快速且不可逆[7],是由于其獨(dú)特的致病性和發(fā)病過(guò)程,導(dǎo)致了結(jié)核病診斷面臨著發(fā)病率高和檢出率低的情況[8]。有學(xué)者[4]指出,當(dāng)痰涂片和抗酸染色結(jié)果出現(xiàn)陰性時(shí),病理診斷在結(jié)核病的確診中意義重大。隨著分子病理學(xué)的迅速發(fā)展,RT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用在提高石蠟樣本結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的檢出中發(fā)揮著重要作用。RT-PCR檢測(cè)石蠟樣本抗酸桿菌復(fù)合群時(shí),最主要的一步是檢測(cè)DNA分離;不嚴(yán)格控制石蠟組織的切片量,會(huì)影響所提取的DNA的濃度和純度,進(jìn)而影響RT-PCR檢測(cè)的靈敏度[9]。因此,我們要重視RT-PCR在石蠟樣本結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)中的重要性,為結(jié)核病的精準(zhǔn)診治提供可靠的病理學(xué)依據(jù)[10]。

在小標(biāo)本、肺穿刺組織的結(jié)核診斷中,常因?yàn)闃?biāo)本較小,實(shí)驗(yàn)人員會(huì)盡可能地多切組織標(biāo)本,從而提高總基因組中結(jié)核分枝桿菌DNA的數(shù)量,但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)樣本切得過(guò)多時(shí),組織消化不夠,導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌不能完全釋放,會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但是,每個(gè)實(shí)驗(yàn)人員對(duì)于組織的大小、切片厚度和切片數(shù)量的把握都存在一定的差異,因此規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量就極為迫切;同時(shí)也希望在未來(lái)的工作中有效能更高的試劑盒來(lái)輔助提取石蠟樣本中的結(jié)核分枝桿菌DNA,最大限度使結(jié)核分枝桿菌釋放出來(lái);或通過(guò)特殊濾網(wǎng)攔截基因組較大的標(biāo)本DNA,濾過(guò)相對(duì)較小的結(jié)核分枝桿菌DNA,盡可能地保留結(jié)核分枝桿菌DNA,進(jìn)而提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率[11]。

本研究結(jié)果表明規(guī)范切片后樣本DNA的濃度和純度均有所提高?？偟膩?lái)說(shuō),為滿(mǎn)足本實(shí)驗(yàn)室的需要,將樣本控制在100～400 ng/μL較為適宜。對(duì)DNA濃度超過(guò)范圍的樣本進(jìn)行適度稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),這與2018年楊軍等[6]在甲醛固定石蠟包埋的組織中提取DNA樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)的多中心調(diào)研中提出的方法一致,該調(diào)查提出切片量過(guò)多和過(guò)少都會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差,對(duì)DNA濃度過(guò)低的樣本需要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上增加切片量,如增加切片厚度或是增加切片張數(shù)等。除了樣本DNA的濃度外,DNA的純度同樣對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響,樣本污染程度也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,這與實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中是否嚴(yán)格消毒實(shí)驗(yàn)環(huán)境、規(guī)范操作流程有關(guān)[6]。

本研究所使用的標(biāo)本均為石蠟樣本,而石蠟樣本的DNA質(zhì)量是獲得正確結(jié)果的重要保障[12]。本研究基于樣本濃度和純度的結(jié)果分析,根據(jù)石蠟樣本組織的大小,總結(jié)了規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量前后的樣本DNA濃度和純度的變化情況(未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析),而有關(guān)樣本DNA的完整性還有待進(jìn)一步分析和探討。

綜上所述,基于本實(shí)驗(yàn)室情況,我們根據(jù)組織的大小,將切片量控制在24～120 μm,切片厚度為6 μm,詳細(xì)切片厚度和切片總量參考表1。在整個(gè)切片過(guò)程中,需要根據(jù)組織的大小在建議范圍內(nèi)控制切片量,有利于在進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)時(shí)提高樣本DNA的濃度和純度,有助于提高實(shí)驗(yàn)的精確性,減少不必要損耗,確保診斷的正確性。

表1 不同大小組織切片厚度和切片總量參考表