徐思蕾,陳 潼,張小建,孫明菡

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610054; 2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心,四川 成都 610072)

輔助生殖技術(shù)發(fā)展四十年來,隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)和玻璃化冷凍體系的不斷成熟和完善,試管嬰兒的妊娠率已顯著提高[1,2]。為降低多胎妊娠率、提高胚胎著床率[3],實(shí)驗(yàn)室囊胚培養(yǎng)技術(shù)在臨床日益重視。胚胎基因組激活階段是從受精后第3天卵裂期胚胎開始到囊胚形成,要真實(shí)評(píng)估胚胎發(fā)育潛能必須實(shí)現(xiàn)胚胎基因組從母體型到胚胎型的轉(zhuǎn)變[4],發(fā)育潛能較差的胚胎在胚胎基因組激活階段被淘汰[5]。因此普遍認(rèn)為與卵裂期胚胎相比,能形成囊胚的胚胎具有更好的種植潛能,囊胚移植具有較高的著床率和活產(chǎn)率[6]。如何選擇發(fā)育潛能更高的囊胚移植是輔助生殖技術(shù)中最主要的挑戰(zhàn)之一。Gardner形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)體系是現(xiàn)階段臨床上用于優(yōu)質(zhì)囊胚篩選的主要方法[7,8],這一評(píng)價(jià)體系的形態(tài)學(xué)參數(shù)包括囊胚擴(kuò)張和孵化階段的形態(tài)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)及滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophectoderm,TE)等級(jí)。越來越多的證據(jù)表明,冷凍和新鮮胚胎移植后的活產(chǎn)率(live-birth rate,LBR)可通過胚胎在體外達(dá)到囊胚階段的能力來預(yù)估[9]。也有研究者對(duì)囊胚形態(tài)學(xué)等級(jí)評(píng)分在預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能中的作用價(jià)值提出質(zhì)疑。有研究報(bào)道ICM和TE等級(jí)評(píng)分可作為臨床上評(píng)價(jià)妊娠率和活產(chǎn)率的一個(gè)重要指標(biāo),對(duì)于優(yōu)質(zhì)囊胚而言,囊胚的TE評(píng)分越高則流產(chǎn)率越低[10]。猜測(cè)原因可能與胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能有關(guān),胚胎著床與著床后分化發(fā)育成胎盤部分的滋養(yǎng)層細(xì)胞存在密切聯(lián)系[11]。但亦有學(xué)者提出囊胚擴(kuò)張和孵化階段形態(tài)、ICM等級(jí)及TE等級(jí)與早期妊娠結(jié)局和新生兒出生結(jié)局無顯著相關(guān)性的觀點(diǎn)[12]。有研究發(fā)現(xiàn),雙囊胚凍融移植D5,D6,D7臨床妊娠率依次降低,胚胎著床率依次減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13,14]。Hiraoka等研究發(fā)現(xiàn),第6、7天優(yōu)囊胚凍融移植周期活產(chǎn)兒的性別比例、早產(chǎn)率、出生體重?zé)o顯著性差異[15]。本研究分析我院生殖中心凍融囊胚移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)患者的臨床資料,探討FET周期中不同分級(jí)的囊胚對(duì)妊娠結(jié)局和新生兒出生結(jié)局的影響,為胚胎實(shí)驗(yàn)室篩選發(fā)育潛能最佳的囊胚提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年5月至2021年12月在四川省人民醫(yī)院生殖中心行FET的不孕患者,總計(jì)2576個(gè)周期。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡在38歲以下(包含38歲);②均行FET;③采用GnRH拮抗劑方案或GnRH激動(dòng)劑降調(diào)節(jié)方案控制促排卵周期;④隨訪數(shù)據(jù)完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①嚴(yán)重子宮畸形明確診斷;②子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥;③子宮內(nèi)膜回聲不均、宮腔積液、宮腔形態(tài)異?；蛭词中g(shù)治療的子宮內(nèi)膜息肉等影響子宮內(nèi)膜容受性疾病;④采用自然周期、微刺激、黃體期促排等刺激方案控制超促排卵周期;⑤供卵、供精試管周期;⑥卵子冷凍解凍周期。本研究采用的移植囊胚均處于擴(kuò)張分期的3～6期。以ICM及TE的致密程度和細(xì)胞數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)囊胚進(jìn)行分期和分級(jí)并以此劃分組別,其中A組(移植≥4AA級(jí)囊胚)108周期,B組(移植4-6AB,4-6BA囊胚)370個(gè)周期,C組(移植4-6BB,4-6CA囊胚)1170個(gè)周期,D組(移植4-6BC,4-6CB,4-6CC囊胚)928個(gè)周期。本研究經(jīng)四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1控制性促排卵方案及體外受精 控制性促排方案包括GnRH激動(dòng)劑降調(diào)節(jié)方案和GnRH拮抗劑方案,以竇卵泡直徑及卵巢激素水平為參考標(biāo)準(zhǔn)給予150～300 IU/d范圍內(nèi)的促性腺激素(gonadotropin,Gn),主導(dǎo)卵泡平均直徑達(dá)18 mm時(shí)給予人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)。至少2個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)18 mm或至少3個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)17 mm以上時(shí)采用重組絨促性素(艾澤,默克雪蘭諾公司,國藥準(zhǔn)字SJ20130091)250 μg或5000～10000 IU hCG(珠海麗珠醫(yī)藥公司,國藥準(zhǔn)字H44020642)扳機(jī),36～38 h后行取卵術(shù)。將所有獲得的卵母細(xì)胞置于37 ℃、5% O2、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。決定行IVF或ICSI中的何種受精方式需視取卵日男方精液情況而定。脫除顆粒細(xì)胞在授精后4.5 h進(jìn)行并觀察卵母細(xì)胞成熟度和雙極(2PB)情況,若卵母細(xì)胞2PB數(shù)/MⅡ卵數(shù)在30%以下(包含30%)則進(jìn)行補(bǔ)救ICSI (RICSI)。在受精后16～18 h觀察胚胎受精情況。

1.2.2囊胚胚胎培養(yǎng)和評(píng)級(jí) 對(duì)處于卵裂期的胚胎培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察,對(duì)第5～7天形成的囊胚采用Gardner囊胚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)和評(píng)估。按照囊胚腔的擴(kuò)張程度可分6期:1期:早期囊胚,囊胚腔體積未達(dá)到囊胚總體積的1/2;2期:囊胚腔體積大于或等于囊胚總體積的1/2;3期:完全擴(kuò)張囊胚,囊胚腔完全占據(jù)整個(gè)囊胚;4期:擴(kuò)張后的囊胚,囊胚體積比早期囊胚大,透明帶變薄;5期:孵出的囊胚,滋養(yǎng)外胚層開始從透明帶裂口孵出;6期:完全孵出的囊胚,囊胚從透明帶中完全逸出。按照ICM和TE的細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)可分3個(gè)等級(jí):A級(jí):ICM細(xì)胞多而緊密;TE細(xì)胞多且大小均勻適中,致密排列于囊胚周圍;B級(jí):ICM細(xì)胞相對(duì)少,結(jié)合較松散,部分有整體性;TE細(xì)胞數(shù)少,松散排列在囊胚周圍;C級(jí):ICM細(xì)胞極少或近乎無細(xì)胞,并且大小不均勻,結(jié)構(gòu)缺乏整體性;TE細(xì)胞極少或僅只有幾個(gè)大小不均一且排列稀疏的細(xì)胞。囊胚的擴(kuò)張程度在3期以上,囊胚評(píng)分在3BC/CB以上可行冷凍或移植。

1.2.3冷凍囊胚移植 采用激素替代周期方案、降調(diào)節(jié)人工周期方案及自然周期方案行子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備。當(dāng)超聲提示內(nèi)膜厚度8～14 mm時(shí)加孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜5天后行囊胚移植。移植當(dāng)天解凍囊胚,采用商品化的囊胚解凍復(fù)蘇液體,按照試劑盒說明進(jìn)行囊胚解凍,解凍具體方法參照玻璃化解凍試劑盒(Kitatato日本)說明書進(jìn)行。復(fù)蘇后解凍的囊胚常規(guī)進(jìn)行激光輔助孵化,然后將囊胚轉(zhuǎn)移至37℃、5% O2、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行2 h的培養(yǎng),借助倒置顯微鏡觀察囊胚的擴(kuò)張情況并以此為依據(jù)進(jìn)行分級(jí)評(píng)分。

1.3 觀察指標(biāo)主要包括著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率、雙胎率、多胎妊娠率、異位妊娠率等。在完成囊胚移植的12天后測(cè)量血HCG,臨床妊娠的診斷標(biāo)準(zhǔn)為借助陰道超聲檢查在囊胚移植后的28天可觀察到宮內(nèi)孕囊和原始胎心搏動(dòng);若在宮外可探及孕囊則診斷為異位妊娠,并記錄孕囊的數(shù)目。對(duì)臨床妊娠者隨訪至妊娠結(jié)束。

胚胎著床率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植總周期數(shù)×100%;異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/移植總周期數(shù)×100%;自然流產(chǎn)率=自然流產(chǎn)周期數(shù)/移植總周期數(shù)×100%;雙胎妊娠率=雙胎妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;多胎妊娠率活產(chǎn)率=多胎妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%,活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。妊娠滿28周,胎兒娩出后有心跳、呼吸、臍帶搏動(dòng)、隨意肌收縮4項(xiàng)生命指標(biāo)之一者稱為活產(chǎn);妊娠滿28周但不足37周即分娩者稱為早產(chǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析;計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,比較采用卡方檢驗(yàn);不同參數(shù)對(duì)臨床妊娠率及活產(chǎn)率的影響采用多因素Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組患者基線資料及控制性促排卵周期比較本研究總共納入2576個(gè)FET,四組患者年齡分別是(30.0±4.4)歲、(29.9±4.3)歲、(30.2±4.4)歲、(31.0±4.4)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)分別是(21.2±2.0)kg/m2、(20.5±2.2)kg/m2、(22.7±5.1)kg/m2、(21.8±3.3)kg/m2。不同組別患者年齡、不孕年限、BMI、AMH、基礎(chǔ)性激素水平、子宮內(nèi)膜情況以及促性腺激素總量和天數(shù)進(jìn)行比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見表1。

表1 各組患者的基線資料

2.2 不同囊胚級(jí)別各組患者妊娠結(jié)局比較對(duì)各組囊胚移植后的妊娠結(jié)局進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),A組囊胚移植后的臨床妊娠率最高,高于B、C、D組(P< 0.05),B組臨床妊娠率高于C組和D組(P< 0.05),A組與B組間臨床妊娠率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組患者的著床率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05);各組異位妊娠率、早孕流產(chǎn)率和中孕流產(chǎn)率、多胎妊娠率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組與B組、A組與C組、C組與D組間的雙胎妊娠率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組妊娠結(jié)局比較

2.3 凍融囊胚移植周期臨床妊娠率和活產(chǎn)率多因素Logistic回歸分析多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,囊胚ICM和TE評(píng)分是臨床妊娠率和活產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見表3、表4。

表3 臨床妊娠率的多因素Logistic回歸分析

表4 活產(chǎn)率的多因素Logistic回歸分析

3 討論

隨著胚胎實(shí)驗(yàn)室體外囊胚培養(yǎng)技術(shù)的日趨成熟,通過形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)篩選具有較高發(fā)育潛能的囊胚成為胚胎移植中非常關(guān)鍵的步驟。本研究納入2576個(gè)凍融囊胚移植周期進(jìn)行分析,結(jié)果顯示凍融囊胚的ICM和TE評(píng)級(jí)對(duì)囊胚發(fā)育潛能、著床率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率方面具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。Gardner評(píng)分是人類輔助生殖技術(shù)實(shí)驗(yàn)室操作專家共識(shí),也是目前國際上主要使用的囊胚評(píng)級(jí)方法[16]。陳夢(mèng)茜等研究顯示囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量和整倍體胚胎著床率成正相關(guān)趨勢(shì),A級(jí)ICM胚胎移植著床率高于B級(jí)[10]。因此,本研究采用ICM和TE兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分組,結(jié)果提示囊胚ICM和TE評(píng)分與臨床妊娠率和活產(chǎn)率存在密切關(guān)聯(lián)且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著囊胚ICM和TE評(píng)分的增高,臨床妊娠率和活產(chǎn)率亦增高。各組的著床率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著ICM和TE評(píng)分增加,著床率下降。然而,流產(chǎn)率相關(guān)指標(biāo)的比較在各組中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此提示,在囊胚移植中囊胚的ICM及TE評(píng)分可作為妊娠結(jié)局和囊胚發(fā)育潛能的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)之一,但在囊胚分級(jí)相差不大的組間比較中,囊胚的ICM及TE評(píng)分作為預(yù)估發(fā)育潛能的指標(biāo)并未顯示出其優(yōu)勢(shì)。說明囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層評(píng)分對(duì)于凍融囊胚移植后妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)具有一定的參考價(jià)值。

本研究還評(píng)估了不同內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層評(píng)分的囊胚移植后新生兒出生結(jié)局的情況,結(jié)果顯示新生兒出生性別比較A、B、C 三組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但A組男嬰出生率高于D組。新生兒出生體重A、B、C組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但A組新生兒出生體重低于D組。由此提示,在凍融雙囊胚移植中,對(duì)于ICM和TE評(píng)級(jí)均為A的囊胚與ICM和TE評(píng)級(jí)為 BC/CB/CC的囊胚間的比較,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層評(píng)分對(duì)于評(píng)估新生兒的性別和體重具有一定的價(jià)值,且結(jié)果顯示ICM和TE評(píng)級(jí)越高,新生兒為男孩和體重低的概率可能越,可能考慮優(yōu)質(zhì)囊胚移植著床率高,繼續(xù)妊娠率高,雙胎妊娠早產(chǎn)率略高于足月妊娠,因此低體重兒增加趨勢(shì)。然而,對(duì)于ICM和TE評(píng)級(jí)相差不大的組別間新生兒性別和體重的評(píng)估,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層評(píng)分在本研究中并未得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果,未來需要進(jìn)一步探究。

關(guān)于囊胚擴(kuò)張程度是否會(huì)影響凍融囊胚移植后的妊娠結(jié)局和新生兒出生結(jié)局仍存在爭(zhēng)議。但本研究Logistic回歸分析結(jié)果顯示,囊胚擴(kuò)張程度不能作為臨床妊娠率和活產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素(P>0.05)。據(jù)此我們認(rèn)為在對(duì)優(yōu)質(zhì)囊胚的研究中囊胚的擴(kuò)張程度不會(huì)對(duì)囊胚移植后的妊娠結(jié)局產(chǎn)生重大影響。

綜上,在FET中囊胚的ICM及TE評(píng)分尤為重要,是臨床妊娠率和活產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素,對(duì)于新生兒性別和體重的評(píng)估亦有一定價(jià)值,因而可作為凍融囊胚移植后妊娠結(jié)局和新生兒出生結(jié)局預(yù)測(cè)的一個(gè)參數(shù),為制定臨床囊胚移植策略提供參考。