康碧倩，李 悅，何曉璇，肖 振，胡 睿，羅陳亮，喬明宇，吳桂有，李振中，朱曉瑩，黃忠仕

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；3.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 百色 533000；4.右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

神經(jīng)元丟失是多種退行性疾病的發(fā)病原因之一。阿爾茨海默癥（alzheimer's disease， AD）作為一種常見的神經(jīng)退行性疾病，是老年人群中僅次于心臟病、惡性腫瘤和中風(fēng)的第四位死亡原因［1］。目前AD 發(fā)病機(jī)制尚未明確，但被證實(shí)有兩種共同的標(biāo)志性病理變化：β 淀粉樣蛋白斑塊沉積和高磷酸化Tau 神經(jīng)纖維纏結(jié)［2］，二者都會(huì)引起進(jìn)行性神經(jīng)元丟失。

研究表明，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路在細(xì)胞增殖分化和生長調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用［3］。已發(fā)現(xiàn)此通路參與AD 中兩種特殊病理結(jié)構(gòu)的形成［4］，可以調(diào)節(jié)線粒體膜通透性蛋白Bcl-2、Bax 等表達(dá)［5］，因此激活PI3K/AKT 信號(hào)通路可能通過保護(hù)神經(jīng)元免受Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，減少神經(jīng)元丟失，從而延緩AD 發(fā)病進(jìn)展。

神經(jīng)退行性疾病通常與細(xì)胞凋亡過度有關(guān)［6］。Bcl-2 蛋白家族嚴(yán)格調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞凋亡?？沟蛲龅鞍祝ㄈ鏐cl-xl，Bcl-2 等）通過穩(wěn)定線粒體膜的通透性和阻止線粒體細(xì)胞色素C 的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用，促凋亡蛋白（如Bak、Bax 等）使線粒體外膜通透化，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C 和其他凋亡因子，以觸發(fā)細(xì)胞蛋白酶和半胱天冬酶的活化，使細(xì)胞凋亡［7］。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的平衡決定細(xì)胞的存活與否［8］，二者比例可以通過許多信號(hào)通路改變，從而有效傳遞細(xì)胞應(yīng)激信息。

中藥何首烏（polygonum multiflorum thunb）具有預(yù)防及治療神經(jīng)系統(tǒng)病變、提高記憶力的功效［9］，常作為治療AD 的中藥復(fù)方或?qū)７绞褂?，而二苯乙烯苷作為何首烏的一種有效成分，是何首烏發(fā)揮藥效的主要基礎(chǔ)［9］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷（2，3，5，4'-tetrahydroxy stilbene 2-Ο-β-D -glucoside， TSG）神經(jīng)保護(hù)效果良好，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷具有較好的抗癡呆作用，能減少Aβ的表達(dá)并保護(hù)Aβ 代謝產(chǎn)物的神經(jīng)毒性損傷［10-12］。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)旨在探討TSG 通過干預(yù)PI3K/AKT 信號(hào)通路調(diào)控SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的具體靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 購自武漢普諾賽生命科技有限公司。 二苯乙烯苷（批號(hào)：CHB180810）購自成都克洛瑪生物科技有限公司；DMEM-F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、雙抗均購于美國 Gibco 公司；胎牛血清（ 批號(hào)：1943609-65-1）購自美國Sigma 公司；LY294002（批號(hào)：GC15485）、CCK-8 試劑（批號(hào)：GK10001）購自上海宏葉生物科技有限公司；岡田酸（批號(hào)：AO1IS211161）購自上海源葉生物科技有限公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒（編號(hào)：C1806）購自碧云天生物技術(shù)公司；ECL 發(fā)光底物檢測試劑盒（批號(hào)：HR20230328M）購自荷瑞生物；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)：SA00001-2）購自武漢三鷹，兔抗AKT 購自abclonal，兔抗PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、Bcl-2、Bax 均購于Affinity。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo，熒光倒置顯微鏡購自Leica，熒光定量PCR 儀購自杭州博日，凝膠電泳儀購自北京六一科技。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 在DMEM-F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入15%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液配置成完全培養(yǎng)基，將含完全培養(yǎng)基的細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12～24 h 觀察細(xì)胞及培養(yǎng)基狀態(tài)，并及時(shí)換液。觀察細(xì)胞生長至細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部80%～90%且生長狀態(tài)良好，1×PBS 清洗三次后用1 mL 0.25%胰蛋白酶反復(fù)均勻吹打使之成為細(xì)胞懸液，待細(xì)胞在顯微鏡下呈單一、均勻形態(tài)時(shí)終止消化，換上現(xiàn)配的新鮮完全培養(yǎng)基，均勻分至新的2～3 個(gè)培養(yǎng)瓶后放入恒溫培養(yǎng)箱，使細(xì)胞繼續(xù)生長。

1.2.2 篩選出最適宜OA 濃度 待細(xì)胞生長至80%～90%且生長狀態(tài)良好時(shí)，棄去原有完全培養(yǎng)基，將消化后的細(xì)胞按每孔5×104個(gè)接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至80%左右，按實(shí)驗(yàn)設(shè)置分別加入OA 終濃度為0、10、20、40、80、160 nmol/L 的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，96 孔板最外圈空白孔內(nèi)每孔加入100 μL 完全培養(yǎng)基，置入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃培養(yǎng)箱培育1 h 后用酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm處的吸光度（OD 值），并計(jì)算生存率。生存率=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對照組-空白組）×100%

1.2.3 細(xì)胞分組及處理 取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，分為對照組、模型組、TSG 組、PI3K 抑制劑LY294002 組和LY294002+TSG 組。對照組采用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，模型組、TSG 組加入含OA（40 nmol/L）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，TSG 組再加入以完全培養(yǎng)基配置的100 μmol/L TSG 溶液24 h（此濃度及作用時(shí)間根據(jù)本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定）；在模型組給藥的基礎(chǔ)上，LY294002 組和LY294002+TSG 組用含LY294002（20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基預(yù)處理6 h 后，LY294002+TSG 組再加入含TSG（100 μmol/L）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞存活情況 按1.2.3中方法處理各組細(xì)胞，接種于96 孔板，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，密度為5×104/孔，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK8 試劑，37 ℃培養(yǎng)箱培育1 h 后用酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm 處的吸光度（OD 值），并計(jì)算生存率。生存率=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對照組-空白組）×100%

1.2.5 TUNEL 法檢測各組細(xì)胞凋亡情況 按1.2.3 中方法處理各組細(xì)胞，PBS 洗滌一次后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，再用含0.3% Triton X-100 的PBS 室溫孵育5 min，按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書配置TUNEL 檢測液，在樣品中加50 μL TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育60 min，隨后加入DAPI 避光孵育5 min，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下隨機(jī)視野觀察。用Imagy J 軟件分別對TUNEL 陽性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）和 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞（細(xì)胞總數(shù)）計(jì)數(shù)，細(xì)胞凋亡率＝TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 Western Blot 檢 測P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)情況 按1.2.3 中方法處理各組細(xì)胞，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 清洗3 次后，加入裂解液（RIPA：蛋白酶抑制劑：蛋白磷酸酶抑制劑=100∶1∶1）于冰上裂解30 min，收集裂解液并于12 000 rpm 離心5 min 后取上清液，采用BCA 法蛋白定量，用酶標(biāo)儀測562 nm 波長條件下的吸光值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。對制備好的蛋白樣品采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行蛋白電泳，電泳前30 min 采用80 V 電壓，電泳至分離膠后采用120 V 電壓，將“三明治轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)”放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，放入冰浴中，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1 h 后，切斷電源。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入PI3K（1∶1 000）、P-PI3K（1∶500）、AKT（1∶1 000）、P-AKT（1∶500）、Bcl-2、Bax（均為1∶500）等一抗4 ℃過夜，TBST 洗膜三次，每次10 min，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜三次，每次10 min，最后將洗好的膜放入ECL 發(fā)光試劑中浸泡潤濕后，避光顯影。結(jié)果用Image J 分析蛋白條帶灰度值，用P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、Bcl-2/Bax 灰度比值表示，并對各組進(jìn)行歸一化。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（qRT-PCR）檢測PI3K、AKT、Bcl-2、Bax mRNA 表達(dá)情況 收集細(xì)胞，提取RNA，并用紫外分光光度計(jì)測定OD 260/280 值，介于1.8～2.0 表明樣本提取的RNA 濃度較高，可以進(jìn)行后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。按照cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明指示，配置20 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：25 ℃孵育10 min 后，42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。繼續(xù)配置qRT-PCR 反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性600 s，95 ℃變性5 s， 60 ℃退火延伸20 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。各目的基因相對表達(dá)量的結(jié)果均以GAPDH 為內(nèi)參基因，目的基因的CT 值以2-△△CT法計(jì)算。具體引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以（±s）表示，兩組組間均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度OA 對細(xì)胞存活率的影響

實(shí)驗(yàn)表明，SH-SY5Y 細(xì)胞經(jīng)0、10、20、40、80、160 nmol/L 濃度梯度的OA 處理24 h 后，隨著OA濃度的增高，細(xì)胞存活率呈逐漸下降趨勢。與對照組比較，40、80、160 nmol/L OA 濃度組細(xì)胞存活率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.022，P＜0.05；t=13.041，P＜0.01；t=15.176，P＜0.01）。當(dāng)OA 濃度小于或等于40 nmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率在80%以上，為盡量保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)決定采取40 nmol/L 作為最終OA 加藥濃度。見圖1。

2.2 二苯乙烯苷對細(xì)胞增殖能力的影響

圖1 不同濃度OA 對細(xì)胞存活率影響Fig 1 Effect of different concentrations of OA on cell viability

將各組細(xì)胞按上述1.2.3 分組進(jìn)行藥物干預(yù)后，與對照組相比，模型組細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01），與模型組相比，TSG 組細(xì)胞活力得到有效緩解（P＜0.05），LY294002 組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；而LY294002+TSG 組 比 起LY294002 組 細(xì)胞活力得到顯著改善（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞存活率情況Fig 2 Cell survival in each group

2.3 二苯乙烯苷對各組細(xì)胞凋亡率檢測

按照TUNEL 試劑盒操作，DAPI 組表示顯微鏡視野下各組細(xì)胞染上藍(lán)色熒光，而凋亡的細(xì)胞將會(huì)染上綠色熒光，即TUNEL 陽性細(xì)胞，Merge 后凋亡細(xì)胞與未凋亡細(xì)胞處在同一視野下方便進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，與對照組相比，模型組TUNEL 陽性染色細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，TSG 組TUNEL 陽性染色細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），LY294002 組TUNEL陽性染色細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；而加入TSG 后，LY294002+TSG 組相比LY294002組TUNEL 陽性染色細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞凋亡率顯著降低 （P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 各組細(xì)胞凋亡率情況（TUNEL 法，×200）Fig 3 Apoptosis rate in each group （TUNEL method， ×200）

表2 各組細(xì)胞凋亡率（n=3，±s）Tab 2 Rate of apoptosis in TUNEL-positive cells in each group（n=3，±s）

表2 各組細(xì)胞凋亡率（n=3，±s）Tab 2 Rate of apoptosis in TUNEL-positive cells in each group（n=3，±s）

注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05；與LY294002 組相比，△P＜0.05。

細(xì)胞凋亡率（%）6.33±1.54 39.58±1.87**11.13±6.40#61.61±12.92#34.72±11.00△22.7＜0.001組別對照組模型組TSG 組LY294002 組LY294002+TSG 組F P

2.4 二苯乙烯苷對各組細(xì)胞中信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況

與對照組相比，模型組P-PI3K（Y607）/ PI3K、P-AKT（Ser473）/AKT 蛋白相對表達(dá)量顯著減少（P＜0.01）；與模型組相比，TSG 組P-PI3K（Y607）/PI3K、P-AKT（Ser473）/AKT 蛋白相對表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），LY294002 組P-PI3K（Y607）/ PI3K蛋白相對表達(dá)量顯著減少（P＜0.01），P-AKT（Ser473）/AKT 蛋白相對表達(dá)量可見較明顯下降，未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與LY294002 組相比，LY294002+TSG 組P-PI3K（Y607）/PI3K、P-AKT（Ser473）/AKT 蛋 白 相 對 表 達(dá) 量 顯 著 增 加（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)比較Fig 4 Comparison of protein expression in cells of each group

2.5 二苯乙烯苷對各組細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)情況

與對照組相比，模型組Bcl-2/Bax 蛋白相對表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，TSG 組Bcl-2/Bax 蛋白相對表達(dá)量顯著上升（P＜0.01），LY294002 組Bcl-2/Bax 蛋白相對表達(dá)量可見較明顯下降，未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與LY294002組相比，LY294002+TSG 組Bcl-2/Bax 蛋白相對表達(dá)量顯著上升（P＜0.01）。見圖4。

2.6 二苯乙烯苷對各組細(xì)胞PI3K、AKT mRNA 的表達(dá)

與對照組相比，模型組PI3K、AKT mRNA 相對表達(dá)量顯著減少（P＜0.01）；與模型組相比，TSG組PI3K、AKT mRNA 相對表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），LY294002 組PI3K、AKT mRNA 相對表達(dá)量顯 著 減 少（P＜0.05）；與LY294002 組 相 比，LY294002+TSG 組PI3K、AKT mRNA 相 對 表 達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。見表3。

2.7 二苯乙烯苷對各組細(xì)胞凋亡因子mRNA的表達(dá)

與對照組相比，模型組Bcl-2 mRNA 相對表達(dá)量顯著下降，Bax mRNA 相對表達(dá)量顯著增加（均P＜0.01）；與模型組相比，TSG 組Bcl-2 mRNA 相對表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），Bax mRNA 相對表達(dá)表 達(dá) 顯 著 下 降（P＜0.05），LY294002 組Bcl-2 mRNA 相 對 表 達(dá) 量 顯 著 下 降（P＜0.01），Bax mRNA 相 對 表 達(dá) 量 顯 著 增 加（P＜0.05）；與LY294002 組 相 比，LY294002+TSG 組 Bcl-2 mRNA 相 對 表 達(dá) 量 顯 著 增 加（P＜0.01），Bax mRNA 相對表達(dá)表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組細(xì)胞PI3K、AKT 及凋亡因子mRNA 相對表達(dá)比較（n=3，±s）Tab 3 Comparison of relative expression of PI3K， AKT and apoptosis factor mRNA in cells of each group（n=3，±s）

表3 各組細(xì)胞PI3K、AKT 及凋亡因子mRNA 相對表達(dá)比較（n=3，±s）Tab 3 Comparison of relative expression of PI3K， AKT and apoptosis factor mRNA in cells of each group（n=3，±s）

注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01；與LY294002 組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

Bax 1.00±0.00 8.86±2.75**3.53±0.74#13.90±1.86#7.84±0.99△△29.86＜0.001組別對照組模型組TSG 組LY294002 組LY294002＋TSG 組F P PI3K 1.00±0.00 0.51±0.10**0.90±0.15##0.25±0.04#0.53±0.07△32.76＜0.001 AKT 1.00±0.00 0.46±0.08**0.78±0.10#0.21±0.04##0.37±0.11△57.91＜0.001 Bcl-2 1.00±0.00 0.45±0.06**0.83±0.11##0.18±0.02##0.43±0.07△64.02＜0.001

3 討論

PI3K/AKT 信號(hào)通路具有廣泛的功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、生長、分化、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸以及更復(fù)雜的過程等。PI3K 是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類，以Ⅰ類最為重要和常用，可被神經(jīng)生長因子、胰島素等信號(hào)通路激活，I類亞型是由調(diào)節(jié)亞基（P85）和催化亞基（P110）組成的異二聚體［13］，根據(jù)其調(diào)節(jié)模式進(jìn)一步分為ⅠA 類（PI3K α，β 和δ）和ⅠB 類（PI3Kγ），調(diào)節(jié)亞基P85 通過其SH2 結(jié)構(gòu)域與活化受體上的磷酸化酪氨酸殘基結(jié)合，然后募集催化亞基P110 以形成完全活性的PI3K 酶［13］。當(dāng)神經(jīng)營養(yǎng)因子或胞外生長因子與跨膜的酪氨酸激酶受體（RTKs）結(jié)合后，RTKs 則會(huì)發(fā)生自身磷酸化，從而募集PI3K 至RTKs 磷酸化部位［14］。 PI3K/AKT 通 路 的 激 活 始 于RTK 激 活PI3K，被激活的PI3K 可活化AKT，AKT 結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化暴露了Thr308 和Ser473 的磷酸化位點(diǎn)，導(dǎo)致Thr308 殘基被PDK1 磷酸化，并在Ser473 處進(jìn)行第二次磷酸化?；罨腁KT 通過激活或者抑制作用調(diào)節(jié)下游靶蛋白Bcl-2（B 細(xì)胞淋巴瘤／白血病-2）；Bcl-2xL（B 細(xì)胞淋巴瘤因子-2XL）等活性，從而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控［15，16］。此條通路與AD 發(fā)病機(jī) 制 具 有 密 切 聯(lián) 系，其 中Wang 等［17］發(fā) 現(xiàn) 激 活PI3K/AKT 信號(hào)通路可以改善AD 小鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)和認(rèn)知障礙，郭學(xué)軍等［18］研究表明激活PI3K/AKT 信號(hào)通路可以降低AD 小鼠腦神經(jīng)凋亡。本實(shí)驗(yàn)選取PI3K P110 催化亞基、AKT Ser473 磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行蛋白檢測，并發(fā)現(xiàn)加入PI3K 抑制劑后P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT 蛋白表達(dá)比值明顯降低，經(jīng)TSG 干預(yù)后P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT 蛋白表達(dá)比值明顯升高，提示TSG 可能通過激活PI3K/AKT 信號(hào)通路而減少細(xì)胞凋亡。

比起正常衰老人群，神經(jīng)元大量丟失在AD 患者群體中更加明顯。對于AD 神經(jīng)元丟失的機(jī)制尚未有廣泛定論，目前主流的形式有細(xì)胞凋亡、壞死、焦亡及其他形式的細(xì)胞死亡（如鐵死亡、銅死亡等）［16］。本實(shí)驗(yàn)選取在AD 神經(jīng)元丟失機(jī)制中探索最廣泛的細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究，采用OA 對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 進(jìn)行誘導(dǎo)，SH-SY5Y 細(xì)胞是一種易于處理和增殖的細(xì)胞系，具有成熟的分化方法，可生成穩(wěn)定的神經(jīng)元培養(yǎng)物［19］，獲得成熟神經(jīng)元樣特征，該細(xì)胞系通常被運(yùn)用于神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的研究中。OA 作為一種蛋白磷酸酶抑制劑，可抑制磷酸酶的活性，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，OA 能誘導(dǎo)Tau 蛋白磷酸化，可用于建立AD 樣細(xì)胞研究模型［20，21］。在本實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，TSG 組細(xì)胞活力增加，凋亡率顯著下降，PI3K/AKT 通路蛋白和基因表達(dá)顯著上升，提示TSG 可能通過干預(yù)PI3K/AKT 通路而一定程度上減少細(xì)胞凋亡。LY294002 作為PI3K/AKT 通路抑制劑，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路的蛋白和基因水平，相比于LY294002 組，LY294002＋TSG 組細(xì)胞凋亡減少，PI3K/AKT 信號(hào)通路蛋白和基因表達(dá)均出現(xiàn)上升，進(jìn)一步證明TSG 對于減少細(xì)胞凋亡的作用是通過PI3K/AKT 信號(hào)通路體現(xiàn)的。

綜上所述，TSG 可能通過干預(yù)PI3K/AKT 信號(hào)通路，從而一定程度上抑制細(xì)胞凋亡。未來可以繼續(xù)探索TSG 對PI3K/AKT 上下游信號(hào)分子的影響，充分闡明其具體的作用機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)度說明：

黃忠仕：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及文章審校；朱曉瑩、李振中：提供Western blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)；李悅、何曉璇：負(fù)責(zé)細(xì)胞培養(yǎng)、藥物干預(yù)；肖振、胡睿、羅陳亮、喬明宇、吳桂有：負(fù)責(zé)指標(biāo)檢測、數(shù)據(jù)分析；康碧倩：撰寫論文。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。