馬萌萌，李淑嫻，吳懷通

(林木遺傳育種全國重點(diǎn)實驗室，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，林木遺傳與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇省林木遺傳和高效培育重點(diǎn)實驗室，南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

蘿藦(Metaplexisjaponica(Thunb.)Makino)是多年生草本纏繞藤本植物，廣泛分布于中國、日本、韓國和俄羅斯[1]。它全株含有豐富的白色乳汁，其中幼葉、根和果實可作為蔬菜栽培[2]。同時，還可以作為中藥用于治療創(chuàng)傷性損傷、蛇咬傷、體質(zhì)虛弱和小兒疳積等[3-4]。蘿藦的粗提物中的化學(xué)成分已被證實具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗氧化、抗菌、免疫抑制和神經(jīng)保護(hù)作用[5-7]。目前，已從蘿藦中分離出類固醇糖苷、配體、黃酮類化合物、揮發(fā)油和脂肪油等化合物[8]。

蘿藦種子上附著長長的種毛，起到輔助種子擴(kuò)散的作用。該種毛是一種高產(chǎn)的天然纖維，可以通過人工或機(jī)械方式進(jìn)行剝離，纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)與棉纖維或楊絮纖維類似，都是由細(xì)胞壁組成的中空組織[4]。蘿藦種毛的中空特性可以作為天然的吸油材料，具有較高的吸油能力、環(huán)境相容性和良好的可重復(fù)性[9-10]。同時，其較大的表面積比、豐富的空隙和中空纖維的充分活化，可以促進(jìn)對亞甲基藍(lán)的高效吸附，為染料分子的吸附提供良好的生物材料[11]。

植物葉綠體是進(jìn)行光合作用的主要場所，并參與合成和分解淀粉、脂肪酸、色素和氨基酸等生化過程[12-14]。葉綠體攜帶一定的遺傳信息，主要是光合作用相關(guān)酶，在核基因的協(xié)助下，可以半自主地完成基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。葉綠體基因組屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳，高度保守，在細(xì)胞質(zhì)中能完成自我復(fù)制，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和低突變率。因此，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，在植物系統(tǒng)進(jìn)化、細(xì)胞質(zhì)不育基因克隆等研究中，葉綠體基因組的分析逐漸呈現(xiàn)出優(yōu)勢[15]。另外，在蘿藦科植物的分類研究中，與夾竹桃科以及下面的多個亞科或?qū)匍g存在分類的爭議。利用葉綠體基因組可以更好地梳理蘿藦科植物的分類進(jìn)化關(guān)系。

目前，蘿藦植物的研究較多處于功能探索階段，包括次生代謝物的提取純化，種毛的結(jié)構(gòu)和應(yīng)用功能等。蘿藦的分子研究報道較少，尤其是基因克隆、基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)更是鮮有報道。因此，本研究以蘿藦為實驗材料，首次系統(tǒng)研究蘿藦葉綠體的基因組結(jié)構(gòu)、基因組成，并結(jié)合蘿藦科其他植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，明確了蘿藦在進(jìn)化中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘿藦種子收集自南京林業(yè)大學(xué)白馬實驗基地，種植在植物生長室。待植株生長達(dá)到6～8片真葉時，采集植株新鮮無病蟲害的嫩葉，放置在液氮中冷凍，并保存在-80 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 構(gòu)建基因文庫并測序

使用CTAB法[16]提取蘿藦總DNA，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計檢測提取的DNA質(zhì)量，包括完整性、濃度和純度。將DNA使用超聲波打碎并篩選出長約500 bp的片段，根據(jù)Illumian DNA文庫構(gòu)建說明書完成文庫的構(gòu)建。構(gòu)建完成的DNA文庫，委托南京集思慧遠(yuǎn)在Illumina Novaseq6000高通量測序平臺完成葉綠體基因組測序。

1.2.2 葉綠體基因組的組裝和注釋

對測序下機(jī)的數(shù)據(jù)，使用NGSQC ToolKit 軟件[17]進(jìn)行測序序列(raw reads)質(zhì)控，包括去除接頭、低質(zhì)量序列、模糊序列和格式轉(zhuǎn)換等，獲得高質(zhì)量序列(clean reads)。使用bowtie2軟件[18]，在clean reads中篩選來自葉綠體的測序序列，使用SPAdes軟件[19]完成葉綠體基因拼接。為確保基因注釋的準(zhǔn)確性，采用兩種方法進(jìn)行基因注釋。一是使用prodigal v2.6.3[20]完成葉綠體基因的CDS注釋，使用hmmer v3.1b2[21]完成rRNA的預(yù)測；二是根據(jù)NCBI上公布的近緣物種，提取基因序列，使用blast v2.6比對組裝的序列，得到兩種注釋結(jié)果。最后，將兩種結(jié)果進(jìn)行手動檢查存在差異的基因，去除冗余和注釋錯誤基因，確定外顯子邊界，獲得最終的基因注釋結(jié)果。

1.2.3 蘿藦葉綠體基因組SSR分析

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)又稱微衛(wèi)星基因座，是由1～6個核苷酸序列為單元多次串聯(lián)重復(fù)組成的序列，這種序列特征在真核生物基因組中廣泛分布[22-23]。葉綠體基因組上的SSR標(biāo)記使用MISA v1.0軟件[24]進(jìn)行葉綠體基因組簡單重復(fù)序列位點(diǎn)(chloroplast simple sequence repeats cpSSR)的分析，重復(fù)基序和重復(fù)次數(shù)分別設(shè)置為單堿基重復(fù)8次，2個堿基重復(fù)5次，3～6個堿基各重復(fù)3次，2個SSR位點(diǎn)間的距離不小于100 bp，對分析得到的cpSSR類型、數(shù)量等進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4 葉綠體全基因組比較分析及共線性分析

為展現(xiàn)蘿藦與近緣物種在葉綠體基因組序列的近緣關(guān)系，分析構(gòu)成基因組的4個不同區(qū)域的邊界序列。近緣物種的葉綠體基因組序列在NCBI網(wǎng)站下載，包括馬利筋(Asclepiasnivea，NCBI登錄號為NC_022431)、地稍瓜(Cynanchumthesioides，NCBI登錄號為MW864598)、匙羹藤(Gymnemasylvestre，NCBI登錄號為NC_047175)、球蘭(Hoyacarnosa，NCBI登錄號為NC_045868)、Vincetoxicumhainanense(NCBI登錄號為NC_051946)、通光散(Marsdeniatenacissima，NCBI登錄號為MW861760)、南瓜子金(Dischidiaaustralis，NCBI登錄號為OL790122)共7個物種葉綠體基因組。使用mVISTA軟件默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行基因組比對。

1.2.5 蘿藦葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

在NCBI網(wǎng)站下載已經(jīng)公開的蘿藦科的近緣物種葉綠體基因組，共下載了25個葉綠體序列(表1)。利用全基因組序列構(gòu)建最大似然(maximum likelihood，ML)系統(tǒng)發(fā)育樹。物種間的序列使用MAFFT v7.427完成多序列比對，使用RAxML v8.2.10軟件，設(shè)置GTRGAMMA模型，rapid Bootstrap分析，bootstrap=1 000，完成進(jìn)化樹構(gòu)建。

表1 蘿藦近緣物種葉綠體基因組序列信息Table 1 Information of chloroplast genome sequences of related species of Metaplexis japonica

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿藦葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

蘿藦的高通量測序數(shù)據(jù)下機(jī)質(zhì)量控制后，獲得6.71 G的高質(zhì)量測序序列。通過基因組的拼接，獲得蘿藦的葉綠體基因組的總長度為157 081 bp，由大單拷貝區(qū)(LSC，88 972 bp)、小單拷貝區(qū)(SSC，18 657 bp)與間隔兩個區(qū)域的兩個反向重復(fù)區(qū)(IRA和IRB，均24 726 bp)4部分組成(圖1)。4個區(qū)域的GC含量也不相同，其中IRA和IRB區(qū)的GC含量最高達(dá)到43.33%，SSC區(qū)的GC含量最低是32.25%。

圖1 蘿藦葉綠體基因組圖譜Fig.1 Chloroplast genome map of Metaplexis japonica

蘿藦葉綠體全基因組預(yù)測了132個基因，其中：包括87個編碼蛋白基因，37個tRNA基因，8個rRNA基因?；蚬δ茏⑨尳Y(jié)果顯示，這些基因可以分為4類(表2)。第一類為光合作用相關(guān)基因，包含45個成員，參與和維持了植物的光合作用反應(yīng)。這些基因中，除了ndhA、ndhB、petB、petD和atpF含有1個內(nèi)含子外，其他基因均不含有內(nèi)含子。另外ndhB基因還存在兩個重復(fù)基因，其他均為一個拷貝。第二類是自我復(fù)制相關(guān)的基因，主要是維持葉綠體在細(xì)胞質(zhì)中完成復(fù)制(表2)。這些基因包括74個成員，提供了遺傳信息轉(zhuǎn)錄和翻譯的基本條件，例如核糖體亞基基因、RNA聚合酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因等。它們相比光合作用相關(guān)基因，存在較大比例的基因出現(xiàn)拷貝數(shù)增加或高比例內(nèi)含子。第三類是其他功能基因，包括6個成員，可能起到調(diào)控或物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，比如轉(zhuǎn)錄起始因子infA和囊膜蛋白基因cemA。第四類是一些功能基因。

表2 葉綠體基因功能分類統(tǒng)計表Table 2 Classification and statistics of chloroplast gene functions

2.2 蘿藦葉綠體基因組散在重復(fù)序列及SSR位點(diǎn)分析

散在重復(fù)序列是以分散的方式分布在基因組中的重復(fù)序列，較多是由于DNA轉(zhuǎn)座導(dǎo)致形成。因此，散重復(fù)序列的長度不定，從幾十到幾千堿基均可發(fā)生。使用vmatch v2.3.0軟件鑒定蘿藦葉綠體基因組中的散在重復(fù)序列。鑒定形式包括正向重復(fù)(forward，F(xiàn))、回文重復(fù)(palindrome，P)、反向重復(fù)(reverse，R)和互補(bǔ)重復(fù)(complement，C)4種。結(jié)果顯示，蘿藦葉綠體中散在重復(fù)序列在不同形式間存在較大差異，其中正向重復(fù)最多為78次，互補(bǔ)重復(fù)最少為2次。同時，重復(fù)片段也存在較大差異，重復(fù)片段長度為30～102 bp不等。其中，33 bp序列的重復(fù)次數(shù)最多為30次，50、53、54 bp等較大片段的重復(fù)次數(shù)最少為1次(圖2)。

圖2 散在重復(fù)序列統(tǒng)計圖Fig.2 Statistical chart of scattered repetitive sequences

簡單重復(fù)序列(SSR)由于其在基因組中的廣泛分布，由此開發(fā)的SSR分子標(biāo)記成為分子生物學(xué)中的重要工具之一。在蘿藦葉綠體基因組中鑒定了271個SSR位點(diǎn)，單堿基重復(fù)169個，數(shù)量最多，雙堿基重復(fù)13個，三堿基重復(fù)77個，四堿基重復(fù)8個，六堿基重復(fù)4個，沒有檢測到五堿基重復(fù)序列。出現(xiàn)頻率最高的簡單重復(fù)序列是A/T，之后是三堿基重復(fù)序列的TAA/TCT(圖3)。

圖3 SSR各類型數(shù)量統(tǒng)計圖Fig.3 Statistical diagram of the quantity of SSR types

2.3 邊界分析

環(huán)形的葉綠體基因組由IR、LSC、SSC分成4部分組成，有4個邊界。為了探究蘿藦在進(jìn)化過程中，4個部分的邊界是否發(fā)生了擴(kuò)張或收縮。選取了蘿藦的近緣物，選取原則是同一科分類下不同屬的物種葉綠體。包括馬利筋屬(Asclepiasnivea)、鵝絨藤屬(Cynanchumthesioides)、匙羹藤屬(Gymnemasylvestre)、球蘭屬(Hoyacarnosa)、白前屬(Vincetoxicumhainanense)、牛奶菜屬(Gongronemopsistenacissima)和眼樹蓮屬(Dischidiaaustralis)共7個物種的葉綠體與蘿藦葉綠體基因組進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，8個物種的葉綠體基因組長度在157 081～176 733 bp，基因組間存在一定的堿基數(shù)目差異。分析LSC/IRb之間的邊界，在蘿藦、Asclepiasnivea、Gymnemasylvestre、Vincetoxicumhainanense和Cynanchumthesioides均處于rps19與rpl2基因之間；而rpl22基因在Gongronemopsistenacissima、Dischidiaaustralis和Hoyacarnosa中橫跨該邊界。IRb/SSC之間的邊界，在蘿藦、Asclepiasnivea和Gymnemasylvestre中均處于ycf1和ndhF基因之間；在Vincetoxicumhainanense中處于ycf1基因中；在Cynanchumthesioides中處于ycf1和rpl32基因之間；在Gongronemopsistenacissima中是被ycf1基因橫跨該邊界；在Dischidiaaustralis和Hoyacarnosa中處于rpl32和ndhF基因之間。分析SSC/IRa之間的邊界，在蘿藦、Asclepiasnivea、Gymnemasylvestre和Gongronemopsistenacissima中是被ycf1基因橫跨該邊界；在Vincetoxicumhainanense中處于ycf1和trnN基因之間；在Cynanchumthesioides中處于rps15和trnN基因之間；在Dischidiaaustralis和Hoyacarnosa中處于ndhF和rpl32基因之間。分析IRa/LSC之間的邊界，在蘿藦、Asclepiasnivea、Gymnemasylvestre、Vincetoxicumhainanense和Cynanchumthesioides均處于rpl2和trnH基因之間；在Gongronemopsistenacissima、Dischidiaaustralis和Hoyacarnosa中均處于rps19和trnH基因之間?？傮w分析，蘿藦與Asclepiasnivea、Gymnemasylvestre和Vincetoxicumhainanense在葉綠體基因組中的邊界序列相似度最高，也觀察到Vincetoxicumhainanense的JSB邊界上的ycf1基因跨越IRb區(qū)和SSC區(qū)的邊界，JSA邊界上的ycf1發(fā)生位移，體現(xiàn)出Vincetoxicumhainanense的IR區(qū)域向SSC區(qū)擴(kuò)張。還發(fā)現(xiàn)Dischidiaaustralis和Hoyacarnosa兩個物種存在類似的邊界序列，暗示它們在進(jìn)化關(guān)系中處于較近的物種(圖4)。

圖4 葉綠體IR邊界變化分析Fig.4 Analysis of chloroplast IR boundary changes

2.4 蘿藦系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了確定蘿藦在近緣植物中的進(jìn)化地位，選擇蘿藦科和夾竹桃科分類下面不同屬的多種代表植物，以長春花作為外類群，結(jié)合拼接的蘿藦葉綠體基因組序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。一般來說自展值在70以上較為可信，自展值較低則無法準(zhǔn)確區(qū)分，進(jìn)化樹中除了自展值為99和64的兩個節(jié)點(diǎn)外，其余節(jié)點(diǎn)自展值均為100，結(jié)果較為可信。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，整體可以分為3個進(jìn)化分支，除了絡(luò)石屬(TrachelospermumL.)和端茲亞屬(Rhazya)相對其他物種進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，它們各自獨(dú)立進(jìn)化一個分支外。第一個進(jìn)化分支包括白前屬(VincetoxicumL.)、秦嶺藤屬(BiondiaSchltr.)、牛角瓜屬(CalotropisR. Br)和馬利筋屬(AsclepiasL.)；第二個進(jìn)化分支主要包括鵝絨藤屬(CynanchumL.)，其中蘿藦與Cynanchumthesioides進(jìn)化關(guān)系最近；第三進(jìn)化分支包括匙羹藤屬(GymnemaR. Br.)、牛奶菜屬植物(Gongronemopsistenacissima)、眼樹蓮屬(DischidiaR. Br)和球蘭屬(HoyaR.Br.)(圖5)。

圖5 葉綠體系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Chloroplast system evolution analysis

3 討論

葉綠體對維持地球生命起著至關(guān)重要的作用，它是活躍的新陳代謝中心，可以通過光合作用和釋放氧氣將太陽能轉(zhuǎn)化為碳水化合物來維持地球的生命。同時，葉綠體在植物生理和發(fā)育的其他方面發(fā)揮著重要作用，包括氨基酸、脂肪酸、植物激素和維生素等代謝物的合成等[25]，對非生物脅迫也會產(chǎn)生影響[26]。被子植物的葉綠體基因組長度一般認(rèn)為在115～165 kb[27]。蘿藦葉綠體基因組呈環(huán)形，四分體結(jié)構(gòu)典型，包括大單拷貝區(qū)、小單拷貝區(qū)和兩個反向重復(fù)區(qū)。全長157 081 bp，符合被子植物葉綠體總長范圍，與蘿藦科公布的葉綠體基因組序列長度相似，包括黑水藤(Biondiainsignis)[28]、秦嶺藤(Biondiachinensis)[29]、大理白前(Cynanchumforrestii)[30]、銀狗牙花(Tabernaemontanadivaricata)[31]、隔山消(Cynanchumwilfordii)[32]、地梢瓜(Cynanchumthesioides)[33]等。蘿藦葉綠體基因組成功注釋了132個基因，其中主要光合作用相關(guān)基因占比達(dá)到34.1%(45/132)，維持自我復(fù)制相關(guān)基因占比達(dá)到56.1%(74/132)。這兩類基因占葉綠體總基因的絕大部分，與葉綠體分布在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行光合作用，可進(jìn)行自我復(fù)制的細(xì)胞器特征相吻合。

葉綠體簡單重復(fù)序列(cpSSR)，是指位于葉綠體基因組中的SSR位點(diǎn)，它可以提供更多的植物基因組的變異信息，這些位點(diǎn)通常位于非編碼區(qū)，是通過重復(fù)次數(shù)的不同產(chǎn)生個體間的差異。它與核基因組SSR位點(diǎn)相似，但擁有自己不同的特征，包括屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳，全部發(fā)生遺傳重組[34]。在蘿藦葉綠體基因組中，鑒定了271個SSR位點(diǎn)，主要以單堿基A、T重復(fù)為主，其次是三堿基TAA重復(fù)。上述SSRW位點(diǎn)的鑒定，為后續(xù)SSR分子標(biāo)記的開發(fā)提供了可靠的靶位點(diǎn)，這些位點(diǎn)也為蘿藦種質(zhì)資源的鑒定分類等積累分子標(biāo)記信息[35]。

由于蘿藦科與夾竹桃科在物種分類中存在較多的爭議，不同學(xué)者依據(jù)不同植物特征對這兩個科物種的分類有不同觀點(diǎn)。例如有的學(xué)者認(rèn)為兩個科應(yīng)該歸為一個科[36]，有的學(xué)者堅持認(rèn)為分為兩個科，或者置于捩花目龍膽亞目分類下面。近期，研究學(xué)者們通過葉綠體基因組的分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)進(jìn)一步證實了蘿藦科應(yīng)該屬于夾竹桃科的一部分[37-38]。為了鑒定蘿藦的進(jìn)化關(guān)系，在已經(jīng)公布的蘿藦科或夾竹桃科物種中，選擇不同屬的物種葉綠體構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果驗證了蘿藦屬于鵝絨藤屬。同時，夾竹桃科下的白前屬和秦嶺藤屬與蘿藦科下的牛角瓜處于同一進(jìn)化分支，他們在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上更近。進(jìn)一步說明現(xiàn)行的蘿藦科和夾竹桃科分類需要參考分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行更新。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合高通量測序，完成了蘿藦的葉綠體基因組測序和組裝，成功注釋了132個基因，分析了基因結(jié)構(gòu)和預(yù)測基因功能。同時，在葉綠體基因組中鑒定了271個SSR位點(diǎn)，為后續(xù)的SSR分子標(biāo)記開發(fā)提供了基因組和靶位點(diǎn)參考。進(jìn)一步結(jié)合近緣物種，分析了蘿藦在進(jìn)化過程中不同基因組區(qū)域邊界基因的變異，證實了Vincetoxicumpycnostelma在進(jìn)化過程中發(fā)生了IR區(qū)域向SSC區(qū)擴(kuò)張。最后，結(jié)合蘿藦科和夾竹桃科下的不同屬多個物種的葉綠體基因組序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定了蘿藦在進(jìn)化中屬于鵝絨藤屬，還發(fā)現(xiàn)了蘿藦科和夾竹桃科植物分類中需要更新分類的線索。總之，本研究系統(tǒng)分析了蘿藦葉綠體基因組，積累了蘿藦研究的分子數(shù)據(jù)，展現(xiàn)了蘿藦的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。