李波，陳小翔，張文軍，翟爭光，劉化冰，江智敏，徐志強*，

(1.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)開發(fā)分公司，浙江 杭州 310008；2.湖南省煙草公司 長沙市公司，湖南 長沙 410000)

赤霉素生物合成前體物質(zhì)柯巴基焦磷酸和脫落酸生物合成前體物C40環(huán)氧類胡蘿卜素(epoxycarotenoid)均是由質(zhì)體中甲基赤蘚醇-4-磷酸(methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP)途徑合成的香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl-PP，GGPP)產(chǎn)生的。在赤霉素合成代謝途徑中GGPP在柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)、內(nèi)-貝殼杉烯合成酶(ent-kaurene synthase，KS)催化作用下形成內(nèi)-貝殼杉烯(ent-kaurene)；在內(nèi)-貝殼杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase，KO)、內(nèi)-貝殼杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase，KAO)氧化作用下轉(zhuǎn)化為GA12；之后通過GA20-氧化酶 (GA20-oxidase，GA20ox)、GA2-氧化酶 (GA2-oxidase，GA2ox)等合成具有生物活性的赤霉素[1-3]

GA3是赤霉素應(yīng)用最為廣泛的一種，已有研究表明GA3能夠提高作物株高[4]，在多種農(nóng)作物上的推廣應(yīng)用已產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益[5-6]。煙草內(nèi)源激素的水平是影響煙草生長發(fā)育的重要因素，噴施外源激素能誘導(dǎo)作物內(nèi)源赤霉素、脫落酸變化，對植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系產(chǎn)生影響[7]，從而影響植物對礦質(zhì)元素的吸收和碳氮的代謝，改變烤煙的生長和煙葉常規(guī)化學(xué)成分。王林等[8]探究外源激素對中部煙葉品質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，增施赤霉素及生長素均可改善烤后煙葉理化性質(zhì)，且濃度越高效果越優(yōu)。陳富彩[9]通過外源噴施 GA3和生長素(IAA)，發(fā)現(xiàn)無論單施還是配施都對烤煙上部葉碳氮代謝產(chǎn)生顯著影響，使其還原糖含量增加，煙堿含量降低。

脫落酸合成代謝途徑中，玉米黃素在玉米黃素環(huán)氧酶(zeathanxinepoxidase，ZEP)兩步環(huán)氧化作用催化下轉(zhuǎn)變成紫黃素(violaxanthin)，隨后紫黃素進一步轉(zhuǎn)化為兩種9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素(9-cis-epoxy carotenoid)，形式-9-順式新黃素(9-cis-neoxanthin)或9-順式-紫黃素(9-cis-violaxanthin)[10]。在9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(enzyme 9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase，NCED)的作用下，形成黃氧素(xanthoxin)并從葉綠體(質(zhì)體)運出到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，進一步形成脫落酸醛(ABA-aldehyde)和最終的脫落酸[11]。

有研究表明，脫落酸位于赤霉素生物合成途徑的上游，負(fù)調(diào)控赤霉素生物合成基因的表達，調(diào)節(jié)植物生長，脫落酸和赤霉素拮抗調(diào)控種子的萌發(fā)和休眠，赤霉素可以解除脫落酸對植株地上部生長的抑制[11-12]。秦華等[13]的實驗表明，高稈型的水稻品種中內(nèi)源脫落酸含量低，矮稈型的水稻品種中脫落酸含量高，且水稻的株高和苗高與水稻內(nèi)的脫落酸含量呈相反的線性關(guān)系。

赤霉素和脫落酸作為植物體內(nèi)的重要植物激素，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，赤霉素和脫落酸在生物合成的過程中存在相互作用[14]，有研究表明從種子休眠到萌發(fā)過程中，ABA和GA可能作為因果相互影響。精確控制合成ABA和GA含量變化的分子機制尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)錄因子起到關(guān)鍵作用，如MYB96、ABI4、CHOTTO1等也參與調(diào)控了GA的合成。MYB96轉(zhuǎn)錄激活A(yù)BA 生物合成過程中的關(guān)鍵基因NCED2和NCED6，同時也抑制GA生物合成基因GA3ox1和GA20ox1的表達。

煙草內(nèi)源激素的水平是影響煙草生長發(fā)育的重要因素，噴施外源激素能誘導(dǎo)作物內(nèi)源赤霉素、生長素和脫落酸變化[15]，從而對植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系以及植物對礦質(zhì)元素吸收和碳氮代謝產(chǎn)生影響，改變烤煙的生長和煙葉常規(guī)化學(xué)成分。在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中，DELLA蛋白一般被認(rèn)為是GA3信號途徑中一類重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子，但越來越多的研究認(rèn)為其是調(diào)節(jié)多種激素發(fā)揮作用的生長抑制因子[16]。GAI基因是DELLA蛋白重要的控制基因之一，其表達量在植物生長發(fā)育過程中受到多種激素如生長素、赤霉素等激素共同調(diào)節(jié)。圍繞外源激素對煙草生長調(diào)控及品質(zhì)影響，前人已開展了一些研究。如周繼華[17]在煙草外施一定濃度的GA3能使煙株莖尖內(nèi)源激素GA與IAA含量提高，顯著促進煙草株高與節(jié)間距的增長。前人在煙草上對品質(zhì)研究多于對株高調(diào)控研究，且株高研究中激素不同濃度梯度對煙草株高研究較少，而綜合研究外源激素對內(nèi)源激素機理、烤煙生長發(fā)育和品質(zhì)影響得更少。本試驗研究苗床期噴施赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)對烤煙品種中煙100和NC71在生長發(fā)育期間赤霉素和脫落酸含量的動態(tài)變化及相關(guān)生理特性變化和烤后煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，以期為噴施外源生長調(diào)節(jié)劑提高烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為烤煙品種中煙100和NC71，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實驗室提供。試驗于2019年在許昌襄縣王洛鎮(zhèn)開展，試驗地土壤為褐土，選擇有代表性、前茬一致、土壤肥力均勻、地面平整、排灌方便、肥力中上等水平的生茬地塊。2019年3月1日播種，5月1日移栽，7月10日打頂，其他栽培措施按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范執(zhí)行。

5月1日移栽時對準(zhǔn)煙草株心噴施赤霉素和脫落酸，噴施時間為17：30-18：30，噴施時液滴要細(xì)小、均勻，藥液用量以噴施部位濕潤為度，為了減少表面張力，在藥液中加入20 mL·L-1表面活性劑吐溫80，赤霉素濃度為100 mg·L-1，脫落酸的濃度為6 mg·L-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置6個處理，分別為未經(jīng)噴施赤霉素處理的中煙100(ZY100)、NC71(NC71)，經(jīng)噴施赤霉素處理的中煙100(ZY100G)、NC71(NC71G)和噴施脫落酸處理的中煙100(ZY100A)、NC71(NC71A)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 內(nèi)源激素分析測定

于噴施后0、10、20、30、40、50、60、70 d采集各處理中部葉0.5 g 新鮮煙草樣品，用液氮速凍后，存放于-80 ℃冰箱中保存，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)(酶免疫試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)化控中心提供)對赤霉素、脫落酸進行測定。

1.3.2 農(nóng)藝性狀測量

根據(jù)《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法》 (YC/T 142-2010)進行煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查，于噴施后0、10、20、30、40、50、60、70 d測定并記錄株高，每個處理選擇有代表性的5株。

1.3.3 生理指標(biāo)測定

葉綠素含量采用95%乙醇浸提比色法進行測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍比色法進行測定；丙二醛含量使用索來寶試劑盒進行測定。

1.3.4 常規(guī)化學(xué)成分測定

根據(jù)《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動法》 (YC/T 468-2021)、《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續(xù)流動法》 (YC/T 159-2019)、《煙草及煙草制品 鉀的測定 連續(xù)流動法》(YC/T 217-2007)和《煙草及煙草制品 氯的測定 連續(xù)流動法》(YC/T 162-2011)標(biāo)準(zhǔn)測定煙葉煙堿、總糖、鉀和氯含量。鉀氯比為鉀含量除以氯含量。

1.3.5 經(jīng)濟性狀統(tǒng)計

根據(jù)《烤煙》(GB 2635-1992)對烤后煙葉分級，統(tǒng)計各處理產(chǎn)量，以2019年當(dāng)?shù)氐臒熑~收購價格計算產(chǎn)值，統(tǒng)計各處理各等級煙葉比例。

1.3.6 煙草葉片總RNA的提取

RNA提?。翰捎肞lant RNA isolation Aid提取參試材料葉片總RNA，將提取的RNA加入適量DEPC水溶解，于-80 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄：利用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)將待測RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄完畢后加入90 μL Nuclease-free H2O儲存在-20 ℃冰箱備用。引物設(shè)計：引物采用Roche LCPDS2軟件設(shè)計(表1)，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。熒光定量PCR：利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Q311-03，Vazyme)在LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)上進行反應(yīng)。體系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，5 μL；10 μmol·L-1Forward primer，0.2 μL；10 μmol·L-1Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每攝氏度采集5次熒光信號。依據(jù)CT值，計算相對表達量并作圖。

表1 熒光定量引物序列Table 1 Fluorescence quantitative primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用DPS 7.05軟件，采用Duncan新復(fù)極差法比較不同處理間各種指標(biāo)之間的差異；使用Origin Pro 8.5進行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源GA3和ABA處理對烤煙株高的影響

如圖1所示，噴施赤霉素前10 d各處理間株高差異不顯著，20 d和30 d NC71株高顯著低于其他處理，40～70 d株高出現(xiàn)差異，其中ZY100G顯著高于其他處理，70 d時株高為113.24 cm，相比對照(ZY100)升高20%，NC71G相對于NC71升高31%，ZY100、NC71在70 d時株高分別為105.73、80.66 cm。在先噴赤霉素再噴脫落酸處理后，40～70 d ZY100A低于ZY100，NC71A低于NC71。說明噴施赤霉素后能顯著增加株高，且處理后的NC71株高與未處理的中煙100相近，而噴施脫落酸能夠抑制赤霉素對煙株株高的促進作用。

同時期不同處理柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2、4～6同。圖1 不同處理對烤煙株高的影響Fig.1 Effect of different treatments on the plant height of flue-cured tobacco

2.2 不同外源GA3和ABA處理對烤煙內(nèi)源激素的影響

根據(jù)圖2中A可知，噴施赤霉素的NC71G、ZY100G較未噴施赤霉素的NC71、ZY100的內(nèi)源赤霉素顯著增加，先噴赤霉素再噴脫落酸后NC71A、ZY100A較噴施赤霉素的NC71G、ZY100G內(nèi)源赤霉素顯著減少。NC71G在處理20 d后內(nèi)源赤霉素含量比NC71升高30%，表明苗期噴施赤霉素有助于增加植株內(nèi)源赤霉素的含量，而噴施脫落酸會抑制植株內(nèi)源赤霉素的含量，并且品種間對外源赤霉素的響應(yīng)快慢存在差異。

圖2 不同處理對烤煙內(nèi)源激素含量的影響Fig.2 Effect of different treatments on the content of endogenous hormones in flue-cured tobacco

根據(jù)圖2中B可知，6個處理脫落酸含量隨時間逐漸升高，前30 d差異不顯著，處理后40 d時ZY100A脫落酸含量高于ZY100G，60 d以后噴施赤霉素的NC71G、ZY100G較未噴施赤霉素的NC71、ZY100內(nèi)源脫落酸顯著減少，表明苗期噴施赤霉素在還苗期、旺長期對脫落酸影響較小，在成熟期影響較大。并且噴施外源脫落酸后可以提高內(nèi)源脫落酸的含量。

根據(jù)圖2中C可知，處理后10～50 d，噴施赤霉素的NC71G、ZY100G較未噴施赤霉素的NC71、ZY100赤霉素與脫落酸的比值均顯著增加，未噴施赤霉素的NC71、ZY100較噴施脫落酸的NC71A、ZY100A的赤霉素與脫落酸的比值均顯著增加。

2.3 不同外源GA3和ABA處理對內(nèi)源激素相關(guān)基因表達的影響

根據(jù)圖3可知，噴施外源赤霉素后CPS、GA20ox和PSY的基因表達量均上調(diào)，GA2ox基因表達量下調(diào)。在ZY100中CPS和PSY的表達量與對照無顯著差異，GA20ox和GA2ox的基因表達量均與對照有顯著差異。在NC71中除PSY的基因表達量與對照無顯著差異外，其他基因在噴施赤霉素后均與對照有極顯著差異，在噴施脫落酸對各基因表達量的影響與噴施赤霉素處理呈現(xiàn)明顯的相反作用。

“*”和“**”分別表示同一基因不同處理在0.05和0.01水平差異顯著。圖3 不同處理對烤煙赤霉素和脫落酸相關(guān)基因表達量的影響Fig.3 Effect of different treatments on the expression of gibberellin and abscisic acid related genes in flue-cured tobacco

2.4 不同外源GA3和ABA處理對烤煙生理特性的影響

2.4.1 不同外源GA3和ABA處理對葉綠素含量的影響

如圖4所示，噴施后前10 d各處理間葉綠素含量差異不顯著，從30 d開始噴施赤霉素的處理葉綠素含量顯著高于同品種未噴施的處理。其中，NC71A葉綠素含量顯著低于其他處理，ZY100G顯著高于其他處理，說明噴施赤霉素后葉片葉綠素含量顯著增高，且處理后的NC71葉綠素含量與未處理的中煙100相近，噴施脫落酸會降低外源赤霉素對葉片葉綠素含量的影響。

圖4 不同處理對烤煙葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of different treatments on chlorophyll content in flue-cured tobacco

2.4.2 不同外源GA3和ABA處理對丙二醛的影響

根據(jù)圖5可知，噴施后前10 d經(jīng)噴施處理后同品種間丙二醛含量差異不顯著，20 d和30 d ZY100G丙二醛含量顯著低于其他處理，40 d開始噴施赤霉素處理的丙二醛含量顯著低于同品種未噴施處理，噴施脫落酸處理的丙二醛含量顯著高于對照，其中，ZY100G丙二醛含量顯著低于其他處理，NC71A顯著高于其他處理，說明噴施赤霉素后葉片丙二醛含量顯著降低，處理后的NC71丙二醛含量與未處理的中煙100相近，且噴施脫落酸后丙二醛的含量顯著升高。

圖5 不同處理對烤煙丙二醛含量的影響Fig.5 Effect of different treatments on the content of malondialdehyde in flue-cured tobacco

2.4.3 不同外源GA3和ABA處理對可溶性蛋白的影響

根據(jù)圖6可知，噴施后前20 d各處理間可溶性蛋白含量差異不顯著，噴施赤霉素后30 d和40 d的相同品種間可溶性蛋白含量差異不顯著，但含量高于未噴施處理，噴施脫落酸后各品種可溶性蛋白含量顯著降低，50 d開始噴施赤霉素處理的可溶性蛋白含量顯著高于同品種未噴施的處理。其中，NC71A可溶性蛋白含量顯著低于其他處理，ZY100G顯著高于其他處理，說明噴施赤霉素后葉片可溶性蛋白含量顯著提高，處理后的NC71可溶性蛋白含量與未處理的中煙100相近，噴施脫落酸后葉片中可溶性蛋白的含量顯著降低。

圖6 不同處理對烤煙可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of different treatments on the content of soluble protein in flue-cured tobacco

2.5 不同外源GA3和ABA處理對烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響

根據(jù)表2可知，噴施外源赤霉素后中煙100和NC71的烤后煙葉總糖含量、鉀含量、鉀氯比均有所增加，其中噴施外源赤霉素后中煙100和NC71的總糖含量顯著增加，而煙堿含量和氯含量均顯著下降，噴施外源脫落酸與噴施外源赤霉素的結(jié)果截然相反。

表2 不同處理對烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響Table 2 Effects of different treatments on the conventional chemical components of flue-cured tobacco leaves

2.6 不同外源GA3和ABA處理對經(jīng)濟性狀的影響

根據(jù)表3可知，噴施外源赤霉素后烤煙各經(jīng)濟性狀表現(xiàn)較好，各指標(biāo)顯著上升，以ZY100G最優(yōu)，其次是NC71G和ZY100，兩者各性狀差異不顯著，而噴施脫落酸后兩個品種的經(jīng)濟性狀最差。

表3 不同處理對烤煙經(jīng)濟性狀的影響Table 3 Effects of different treatments on economic characters of flue-cured tobacco

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

試驗結(jié)果表明，在對株高的影響上，經(jīng)過外源赤霉素處理的ZY100的株高顯著高于其他3個處理，經(jīng)過外源脫落酸處理的NC71A的株高最低，未經(jīng)處理的ZY100與經(jīng)過外源赤霉素處理的NC71兩組的株高接近。NC71G的株高也顯著高于NC71，噴施脫落酸處理的NC71A、中煙100A株高均顯著低于對照。說明100 mg·L-1的外源赤霉素噴施可以增加煙株株高[18]，6 mg·L-1的外源脫落酸噴施可以降低煙株的株高，脫落酸與赤霉素之間存在明顯的拮抗作用。

在對葉綠素含量和可溶性蛋白含量的影響上，經(jīng)過外源赤霉素處理的ZY100的葉綠素含量和可溶性蛋白含量最高，經(jīng)過脫落酸處理的NC71A含量最低，未經(jīng)處理的ZY100與經(jīng)過外源赤霉素處理的NC71含量接近，經(jīng)過外源赤霉素處理的NC71顯著高于未經(jīng)外源赤霉素處理的NC71，說明100 mg·L-1的外源赤霉素與煙草葉片葉綠素和可溶性蛋白含量呈正相關(guān)[19]，對煙株的生長發(fā)育有著積極的作用，6 mg·L-1的外源脫落酸與葉片葉綠素和可溶性蛋白含量呈負(fù)相關(guān)，對煙株的生長發(fā)育存在抑制作用，與赤霉素相互拮抗。

在對丙二醛含量的影響上，經(jīng)過外源赤霉素處理的ZY100的丙二醛含量最低，而經(jīng)過脫落酸處理的NC71A的丙二醛含量最高，未經(jīng)外源赤霉素處理的ZY100與經(jīng)過外源赤霉素處理的NC71含量接近，經(jīng)過外源赤霉素處理的NC71的丙二醛含量顯著高于未經(jīng)處理的NC71。因為丙二醛反映的是細(xì)胞膜的損傷程度，其含量越高煙草葉片受損就越嚴(yán)重。根據(jù)試驗結(jié)果可知，100 mg·L-1的外源赤霉素可以有效降低煙草葉片丙二醛含量[20]，從而保證煙草葉片的發(fā)育，對煙草的生長發(fā)育有著積極的作用，且赤霉素和脫落酸之間存在明顯的拮抗作用。

在對內(nèi)源赤霉素含量的影響上，經(jīng)過100 mg·L-1的外源赤霉素處理的ZY100G與NC71G的內(nèi)源赤霉素含量顯著高于未經(jīng)過處理的ZY100與NC71，且ZY100G顯著高于其他處理組，NC71G在20 d后顯著高于NC71，而經(jīng)脫落酸處理的NC71A、中煙100A的內(nèi)源赤霉素含量最低，表明在苗床期噴施100 mg·L-1的外源赤霉素可以有效增加煙草葉片內(nèi)源赤霉素的含量[21]，并且該含量的增加在不同的品種間存在差異，且噴施赤霉素和噴施脫落酸在影響植株株高以及內(nèi)源化學(xué)物質(zhì)方面存在明顯的拮抗作用[22]。

3.2 結(jié)論

赤霉素是植物幼苗發(fā)育常用的生長調(diào)節(jié)劑，調(diào)控植物生長發(fā)育整個過程，脫落酸是植物體內(nèi)與赤霉素存在拮抗作用的植物激素。本研究通過對中煙100和NC71苗床期噴施100 mg·L-1外源赤霉素(GA3)和6 mg·L-1外源脫落酸(ABA)的研究中發(fā)現(xiàn)，噴施外源赤霉素可以改善煙草葉綠素、可溶性蛋白、丙二醛和內(nèi)源赤霉素的含量，從而增強煙株的光合作用，加強其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和干物質(zhì)的積累；提高細(xì)胞的保水能力，降低膜質(zhì)的過氧化程度，減少細(xì)胞的受損程度，噴施外源脫落酸后抑制了內(nèi)源赤霉素的含量，提高了內(nèi)源脫落酸的含量，表明脫落酸和赤霉素在煙株生長發(fā)育和內(nèi)源激素方面存在明顯的拮抗作用，同時噴施外源赤霉素使烤后煙葉化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)從而提高煙葉品質(zhì)，并且可以提高經(jīng)濟產(chǎn)量。綜上所述，可在煙草種植苗期噴施適宜濃度的赤霉素來提高煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量，提高煙草農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力。