陳美琪 律振青 馬紹益 張贏月 張妍妍 王俊玲

基金項(xiàng)目：吉林省大學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（2022053）；吉林省科技廳吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（YDZJ202101ZYTS118）。

作者簡(jiǎn)介：陳美琪（2001—），女，吉林松原人，本科。研究方向：發(fā)酵工程。

通信作者：王俊玲（1982—），女，吉林吉林人，博士，副教授。研究方向：分子酶學(xué)工程與發(fā)酵工程。E-mail：wangjunling0432@163.com。

摘 要：目的：優(yōu)化糙米發(fā)酵工藝，以提高γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量。方法：以黃色糙米為原料，添加酵母菌，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)黃色糙米酵素。以GABA含量為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。結(jié)果：黃糙米的最佳發(fā)酵條件為接種量2%、培養(yǎng)時(shí)間40 h、培養(yǎng)溫度32 ℃，該條件下GABA含量為0.456 mg·mL-1。結(jié)論：優(yōu)化后的發(fā)酵條件后可為糙米酵素的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃色糙米；酵母菌；γ-氨基丁酸；發(fā)酵條件

Study on Fermentation Technology of GABA-Rich Yellow Brown Rice Enzymes

CHEN Meiqi， LYU Zhenqing， MA Shaoyi， ZHANG Yingyue， ZHANG Yanyan， WANG Junling*

（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering， Jilin Agricultural Science and Technology University， Jilin 132101， China）

Abstract： Objective： To optimize the fermentation process of brown rice in order to improve increase the content of nutrients such as γ-aminobutyric acid （GABA）. Method： Yellow brown rice is used as raw material， yeast is added， and yellow brown rice enzyme is produced through fermentation. Using GABA content as an indicator， optimize fermentation conditions through single factor and orthogonal experiments. Result： The optimal fermentation conditions for yellow brown rice were 2% inoculation amount， 40 h cultivation time， and 32 ℃ cultivation temperature. Under these conditions， the GABA content was 0.456 mg·mL-1. Conclusion： The optimized fermentation conditions can provide a basis for the production and application of brown rice enzymes.

Keywords： yellow brown rice; yeast; γ-aminobutyric acid; fermentation conditions

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）是糙米酵素中一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有一定的生理活性，是糙米酵素中一種非蛋白組分[1-2]。目前，GABA已被證實(shí)具有降血壓、抗癲癇、止痛、提高記憶力等藥理學(xué)功效[3-6]。酵母菌是一種重要的微生物菌種，在工業(yè)及生物工程中發(fā)揮著重要的作用。有學(xué)者研究東北酸菜發(fā)酵酵母菌凍干保護(hù)劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，酵母菌輔助東北酸菜進(jìn)行發(fā)酵有重大的開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用意義，加入酵母菌可大大提升發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)及安全性，使生產(chǎn)過(guò)程更為可控[7]。糙米酵素是將從酸菜中選育得到的酵母菌接種至糙米培養(yǎng)基中經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的具有一定生物活性的物質(zhì)，含有人體所需的必需元素，能夠促進(jìn)機(jī)體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高免疫力[7]，還能促進(jìn)新陳代謝[8]。

本文選擇具有較高富集GABA能力的酵母菌，將其添加到黃色糙米培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，以得到具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的黃色糙米酵素，為今后利用高產(chǎn)GABA酵母提升糙米酵素營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃色糙米：購(gòu)自陜西漢中洋縣；酵母菌：本實(shí)驗(yàn)室保存；酵母提取粉、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖、蔗糖、碳酸鈉、四硼酸鈉以及苯酚，分析純；GABA標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純，樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9243BL-Ⅲ上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；高速多功能粉碎機(jī)（HC-100T常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3751L-PC松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社）；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（JT202N寧波新芝生物科技股份有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-X100A杭州奧盛儀器有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV756CRT上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將黃色糙米置于烘箱中烘干（30 ℃，40 min），用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。稱(chēng)取3 g黃色糙米粉，與YEPD培養(yǎng)基混合，定容至50 mL，滅菌后接種菌種進(jìn)行發(fā)酵，獲得黃色糙米酵素。

采用超聲法提取GABA，超聲時(shí)間為15 min、超聲功率為350 W，然后于12 000 r·min-1下離心

5 min，上清液即為待測(cè)樣品[9]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1）接種量對(duì)GABA的影響。依據(jù)前期試驗(yàn)，將酵母菌以1%、2%、3%和4%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32 ℃發(fā)酵培養(yǎng)44 h待其發(fā)酵后測(cè)定待測(cè)樣品吸光值，計(jì)算GABA含量。

（2）發(fā)酵溫度對(duì)GABA的影響。將3%酵母菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并于30 ℃、32 ℃、34 ℃和36 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)44 h，測(cè)定待測(cè)樣品吸光值，計(jì)算GABA含量。

（3）發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA含量的影響。將3%酵母菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于32 ℃分別培養(yǎng)32 h、36 h、40 h和44 h，測(cè)定待測(cè)樣品吸光值，測(cè)定GABA含量。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為考察因素，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.3.4 糙米酵素GABA含量測(cè)定

GABA含量測(cè)定方法依據(jù)GABA中游離氨與苯酚及次氯酸鈉產(chǎn)生一系列作用，最終導(dǎo)致樣品產(chǎn)生藍(lán)綠色反應(yīng)進(jìn)行。用Berthelot比色法測(cè)定待測(cè)樣品吸光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算GABA含量[10-11]。

準(zhǔn)確稱(chēng)量10 mg GABA標(biāo)準(zhǔn)品，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液溶解，用純化水定容至10 mL，分別配制成濃度為0 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、

0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶

液。參考文獻(xiàn)[10]，以GABA濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

以GABA濃度為橫坐標(biāo)，OD640值為縱坐標(biāo)，繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1），得到線(xiàn)性方程為y=0.868x+0.017 3，相關(guān)系數(shù)R?=0.996 4。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對(duì)黃糙米GABA含量影響

由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基接入3%酵母菌時(shí)，GABA含量最大；當(dāng)接入酵母菌的量高于3%時(shí)，GABA含量呈下降趨勢(shì)。綜合考慮，本研究選擇2%、3%、4% 3個(gè)水平進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)黃糙米GABA含量影響

從圖3可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到32 ℃時(shí)，GABA含量最大；繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，GABA含量逐漸減小。這可能是因?yàn)殡S著溫度的提高，酵母的增殖和代謝受到了抑制，酵母中的蛋白酶活性減弱，GABA的產(chǎn)量也隨之減少。綜合考慮，正交試驗(yàn)中選取30 ℃、32 ℃、34 ℃進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃糙米GABA含量影響

從圖4可得，GABA含量在發(fā)酵時(shí)間為40 h時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，酵母菌的活力降低，GABA的產(chǎn)量也隨之降低。綜合考慮，選取36 h、40 h、44 h進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，黃糙米的發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA含量的影響最大，其次為酵母菌接種量，發(fā)酵溫度影響最小。分析可知，黃糙米的最優(yōu)發(fā)酵條件為A1B2C2，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)中最佳組合一致，即酵母菌接種量為2%，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時(shí)間40 h，該條件下樣品的吸光度值為0.413，黃糙米中GABA含量為0.456 mg·mL-1。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以黃色糙米為原料，以糙米酵素中GABA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取酵母菌的接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為考察因素，進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，酵母菌發(fā)酵黃糙米的最佳工藝為接種量2%，培養(yǎng)時(shí)間40 h，培養(yǎng)溫度32 ℃，該條件下GABA含量為0.456 mg·mL-1。該試驗(yàn)可為提高糙米的綜合利用率和附加值，以及有色糙米酵素的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)[12-14]。

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