李嬌 羅景陽 李巧蓮 王巖松 陳嬌 宣彤

作者簡介：李嬌（1989—），女，遼寧撫順人，碩士，工程師。研究方向：食品質(zhì)量安全檢測。

摘 要：目的：評估超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）法檢測草魚中恩諾沙星殘留量的不確定度。方法：依據(jù)《測量不確定度評定與表示（含第1號修改單）》（JJF 1059.1—2012）、《測量不確定度要求的實施指南》（CNAS-GL05—2011）、《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019），對草肉中恩諾沙星的殘留量進(jìn)行不確定度評估分析。結(jié)果：當(dāng)草魚中恩諾沙星的殘留量為183 ?g·kg-1時，其擴(kuò)展不確定度為12 ?g·kg-1

（k=2），不確定度主要來源于體積不確定度、UPLC-MS/MS儀器的不確定度。結(jié)論：提高檢驗人員的實驗操作能力，定期校準(zhǔn)UPLC-MS/MS儀，可提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：不確定度；恩諾沙星；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ UPLC-MS/MS）；草魚

Uncertainty Evaluation for the Determination of Enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS

LI Jiao1， LUO Jingyang1， LI Qiaolian1， WANG Yansong1， CHEN Jiao1， XUAN Tong2

（1.Shenyang Institute of Food and Drug Control， Shenyang 110122， China;

2.School of Public Health， Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China）

Abstract： Objective： The uncertainty of measurement in determination of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS is evaluated. Method： According to relevant standards such as JJF 1059.1—2012， CNAS-GL05—2011 and CNAS-GL006： 2019， the uncertainty for the determination of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS was established. Result： When the content of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella was 183 ?g·kg-1， the expanded uncertainty was 12 ?g·kg-1 （k=2）. The uncertainty mainly comes from volume uncertainty and UPLC-MS/MS instrument generated by the uncertainty. Conclusion： Improve the experimental operation ability of inspectors and regularly calibrate UPLC-MS/MS instrument to make it accurate.

Keywords： uncertainty; enrofloxacin; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

（ UPLC-MS/MS）; Ctenopharyngodon idella

測量不確定度在一定程度上反映了實驗室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，檢測結(jié)果的表述包括被測量的值及與該值相關(guān)的測量不確定度。恩諾沙星作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的喹諾酮類動物專用藥物，具有廣譜殺菌的作用。長期食用含有恩諾沙星殘留的魚類，可能導(dǎo)致恩諾沙星在人體內(nèi)蓄積，從而對人體機能造成危害，甚至使人體產(chǎn)生耐藥性，影響人體的軟骨發(fā)育，導(dǎo)致畸形等病變。本文以第三方復(fù)檢樣品草魚為例，對高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry， UPLC-MS/MS）測定恩諾沙星的測量不確定度進(jìn)行分析，建立了測量不確定度評定方案[1]，以期為食用農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測提供技術(shù)支持，從而進(jìn)一步保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

1.1.1 主要儀器設(shè)備

電子天平，賽多利斯儀器公司；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，QTRAP 4500串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；LC-20A型超高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理公司；H2050R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司；Milli-Q型超純水機，美國Millipore公司；1 mL移液器、2 mL移液管（A級）；100 mL容量瓶（A級）。

1.1.2 主要試劑

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 mg，純度99.24%，天津阿爾塔公司）；草魚（第三方檢測機構(gòu)復(fù)檢樣品）；甲醇、乙腈（色譜純）；水（一級水）。

1.2 恩諾沙星的測定方法

稱取2 g（±0.02 g）試樣于50 mL具塞離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，渦旋混合30 s，避光放置

10 min，加入10 g無水硫酸鈉，渦旋混勻，加入20 mL

酸化乙腈，渦旋1 min，超聲10 min，4 000 r·min-1離心收集上清液于50 mL梨形瓶中，重復(fù)提取，將合并的上清液于40 ℃水浴蒸干，用1 mL甲醇復(fù)溶，用

2 mL正己烷脫脂后，取下層清液過0.22 μm膜待測定[2]。本方法中恩諾沙星殘留量的計算公式為

式中：X為恩諾沙星的殘留量，μg·kg-1；C為由標(biāo)曲擬合出的樣品溶液濃度，ng·mL-1；V為樣品定容體積，mL；m為樣品稱樣量，g；frec為回收率校正因子。

1.3 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

準(zhǔn)確稱取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 0 g于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，再用移液管精確吸取2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成濃度為2 μg·mL-1的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

2 不確定度的主要來源

通過分析，本方法不確定度的主要來源如圖1所示[3-4]。

圖1 不確定度的主要來源

3 不確定度量化

3.1 重復(fù)性引入的不確定度

在2.00 g草魚樣品中，加入0.175 mL濃度為

2 μg·mL-1恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液制成加標(biāo)樣，加標(biāo)量為70 μg·kg-1，復(fù)檢樣品草魚中恩諾沙星的殘留量為183 μg·kg-1，加標(biāo)后恩諾沙星的含量為253 μg·kg-1。加標(biāo)樣6次重復(fù)測定的結(jié)果分別為

260 μg·kg-1、251 μg·kg-1、256 μg·kg-1、255 μg·kg-1、252 μg·kg-1和258 μg·kg-1，平均值為255 μg·kg-1，平均回收率為103.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.593 4 μg·kg-1，實驗合成重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.2 UPLC-MS/MS定量校準(zhǔn)引入的不確定度

UPLC-MS/MS定量的允差為3.2%，在均勻分布下，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稱量引入的不確定度

使用賽多利斯BSA224S-CW天平，精度0.1 mg，最大允差為±0.1 mg，取均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（sd） mg。

電子天平稱量不確定度主要為稱量變動性，根據(jù)電子天平技術(shù)參數(shù)，其變動性標(biāo)準(zhǔn)偏差為

0.01 g，實際操作過程中控制在0.02 g，按照均勻分布，則樣品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

u（w） g

因此，由標(biāo)準(zhǔn)品稱量10 mg及樣品稱量2 g引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.4 移液定容體積引入的不確定度

①100 mL容量瓶校準(zhǔn)。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[5]，當(dāng)實驗室環(huán)境溫度為20 ℃時，100 mL容量瓶（A級）的容量允差為±0.10 mL，服從均勻分布，則不確定度為。②重復(fù)性試驗。對100 mL

容量瓶定容10次并用天平稱量，標(biāo)準(zhǔn)偏差為

0.067 9 mL，其不確定度為0.0679/=0.021 5 mL。③溫度試驗。實驗室環(huán)境溫度為（20±5）℃時，甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.1×10-3/℃，在均勻分布下，不確定度為。因此，100 mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

urel（V1）

①1 mL移液器校準(zhǔn)。根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）規(guī)定[6]，1 mL移液器的容量允差為±1.0%，在均勻分布下，不確定度為1.0%/=0.005 80 mL。②重復(fù)性試驗。JJG 646-2006中重復(fù)6次測定的RSD≤0.5%，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.00×0.5%=0.005 mL，即其不確定度。③溫度試驗。實驗室的環(huán)境溫度為（20±5）℃，其不確定度為。因此，合成得

1 mL移液器的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

urel（V2）

在實驗過程中，2次用到了100 mL容量瓶，6次用到了1 mL移液器，因此，由移液定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.5 加標(biāo)回收率實驗引入的不確定度

加標(biāo)回收率實驗引入的不確定度包括樣品在提取凈化過程中及由于儀器波動、重現(xiàn)性等因素引入的不確定度，本文采用3水平3平行共9次加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)量分別為25 μg·kg-1、70 μg·kg-1、

220 μg·kg-1，復(fù)檢樣品草魚中恩諾沙星的殘留量為183 μg·kg-1，加標(biāo)后恩諾沙星的含量分別為208 μg·kg-1、253 μg·kg-1、403 μg·kg-1?；厥章蕿?2.0%～105.0%，平均回收率為99.8%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.017 4 μg·kg-1，因此，加標(biāo)回收率實驗引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4 不確定度結(jié)果分析

將上述各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成，得到合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此，當(dāng)復(fù)檢樣品中恩諾沙星含量為183 μg·kg-1時，合成不確定度為uc=183 ×0.030 1=6 μg·kg-1。當(dāng)包含因子k為2，置信概率p為95%，擴(kuò)展不確定度U=2×6=12 μg·kg-1。

5 結(jié)論

草魚中恩諾沙星的含量為（183±12） μg·kg-1。通過對相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總分析，計算各個不確定度的貢獻(xiàn)率。由表1可知，在UPLC-MS/MS法測定草魚中恩諾沙星殘留量時，移液定容體積引入的不確定度對檢測結(jié)果影響最大，其次是UPLC-MS/MS定量校準(zhǔn)引入的不確定度。因此，在日常檢測中，實驗室檢驗人員應(yīng)注意提高實驗操作能力，同時定期對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，嚴(yán)格控制前處理過程，減少因移液定容體積引入的不確定度，有助于提高實驗室檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和檢測結(jié)果可靠性[7-8]。

參考文獻(xiàn)

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[5]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器：

JJG 196—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

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JJG 646—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

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