孫 婷，劉桂亭，林莎莎，鄒圣燦，王寶群

（青島琛藍海洋生物工程有限公司，山東青島 266104）

羅望子（Tamarindus indica L.） 是蘇木科（Cae salpiniaceae） 酸豆屬（Tamarindus） 的常綠大型喬木[1]，主要產(chǎn)于印度、孟加拉國、緬甸等地，在我國云南、廣西等地區(qū)也有種植[2-4]。羅望子種子中的多糖含量高達60%[5]，其中木葡聚糖（Xyloglucan，XG） 是羅望子種子中的主要成分之一。因XG 資源豐富、工業(yè)生產(chǎn)成本低，又具有穩(wěn)定、增稠等性質(zhì)，可被用于代替果膠、明膠等作為一種食品添加劑，廣泛應用于各種飲品、食品中。除此之外，XG 還有著良好的流變特性[6-7]、凝膠性[8-12]、黏附性[13]、生物相容性[14]，以及藥物緩釋[15-20]、降血糖血脂[21-22]、調(diào)節(jié)膽汁代謝[23]、體內(nèi)防粘連[24-25]等生物活性，使眾多學者越來越關(guān)注其在生物醫(yī)藥、醫(yī)用材料等領域的應用。

羅望子種子中雖含有大量木葡聚糖，但其仍含有蛋白質(zhì)（15.0%～20.0%）[26]、脂肪（3.0%～7.5%）[27]、纖維（2.5%～8.0%）[28]等雜質(zhì)。蛋白質(zhì)和脂肪是羅望子木葡聚糖提取過程中需重點去除的對象，相比之下，脂肪較易去除，而蛋白質(zhì)則較為困難。羅望子種子中的蛋白質(zhì)約有61%為可溶性蛋白，39%為不可溶性蛋白。同時，可溶性蛋白由約21%的鹽溶性蛋白、19%的水溶性蛋白、17%的堿溶性蛋白及4%的醇溶性蛋白組成。因此，想要獲得高純度木葡聚糖的關(guān)鍵是在不引起多糖損失的前提下，高效去除羅望子種子中水溶性蛋白質(zhì)。目前，對于羅望子木葡聚糖的提取純化方法有2 種，分別是經(jīng)典的水提醇沉法和有機酸提取法。水提醇沉法主要是通過醇沉將大部分多糖提取出來，而有機酸提取法則是通過等電點沉降法去除蛋白質(zhì)，2 種方法均可去除羅望子木葡聚糖中部分蛋白質(zhì)。通過這2 種方法制備的多糖，有著溶解性差、純度不高等缺點，極大地限制了羅望子木葡聚糖在生物醫(yī)藥和醫(yī)用材料中的應用，尤其是對于植入體內(nèi)應用的第三類醫(yī)用材料，因為較高的蛋白質(zhì)殘留有導致免疫反應的風險，現(xiàn)亟需一種可以制備高純度羅望子木葡聚糖的方法。采用酸、堿處理，結(jié)合活性炭吸附、透析的方法去除多糖中的蛋白質(zhì)，并對工藝進行初步研究，為木葡聚糖的提取工藝提供新思路，為其在生物醫(yī)藥、醫(yī)用材料、食品、造紙、紡織等領域的應用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

羅望子，云南貓哆哩集團提供；醋酸（分析純）、考馬斯亮藍G-250、85%磷酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；活性炭，福建元力活性炭股份有限公司提供；透析袋（50 kDa），湖南羽博生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司提供；鱟試劑（0.1 mL/支）、細菌內(nèi)毒素檢測用水、內(nèi)毒素標準品（10 EU /支），湛江博康海洋生物有限公司提供。

1.1.2 儀器與設備

SF-2000 型高速粉碎機，上海市藥材有限公司產(chǎn)品；HH-1 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州丹瑞實驗儀器設備有限公司產(chǎn)品；AR224CN 型電子天平，奧豪斯儀器（常州） 有限公司產(chǎn)品；JSB6-02 型電子計重秤，上海浦春計量儀器有限公司產(chǎn)品；DZ267-32C10 型離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；Master-E plus UF 型純水機，上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品；LYO-100FS 型冷凍干燥機，北京開元永盛凍干技術(shù)有限公司產(chǎn)品；T6 型新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品；雷磁PHS-3E型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品；Alpha 型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Bruker 公司產(chǎn)品；AVANCE III HD 400 MHz 型核磁共振譜儀，美國Bruker 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 羅望子木葡聚糖的提取工藝流程

將羅望子種子經(jīng)過烘炒、粉碎、過篩、脫脂處理得到羅望子多糖粗粉；精確稱取一定量的羅望子多糖粗粉，在高溫下，按一定比例用水溶解，將溶液離心取上清液，得到羅望子多糖水提液；向水提液中加入醋酸，調(diào)節(jié)pH 值至2.5～4.5，靜置沉降；再取上清液加入氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH 值至10.5～12.5，靜置沉降；取上清液加入活性炭吸附，離心后將上清液裝入50 kDa 透析袋中透析；將透析后的溶液經(jīng)過冷凍干燥得到羅望子木葡聚糖。

1.2.2 單因素試驗

（1） 料液比對羅望子木葡聚糖純度的影響。分別選取料液比為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，酸處理pH 值為3，堿處理pH 值為12，在其他步驟不變的條件下進行提取，測定樣品蛋白質(zhì)殘留量。

（2） 酸處理pH 值對羅望子木葡聚糖純度的影響。分別選取酸處理pH 值為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，料液比為1∶1，堿處理pH 值為12，在其他步驟不變的條件下進行提取，測定樣品蛋白質(zhì)殘留量。

（3） 堿處理pH 值對羅望子木葡聚糖純度的影響。分別選取堿處理pH 值為10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，料液比1∶1，酸處理pH 值為3，在其他步驟不變的條件下進行提取，測定樣品蛋白質(zhì)殘留量。

1.2.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設計正交試驗。

L9（34）正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素與水平設計

1.2.4 多糖含量檢測

依據(jù)“苯酚- 硫酸法”測定樣品中多糖含量。

1.2.5 蛋白質(zhì)殘留量檢測

依據(jù)《中華人民共和國藥典》 （2020 版） 四部通則0731 蛋白質(zhì)含量測定法中第五法“考馬斯亮藍法（Bradford 法）”測定樣品中蛋白質(zhì)殘留量。

1.2.6 細胞內(nèi)毒素檢測

依據(jù)《中華人民共和國藥典》 （2020 版） 四部通則1143 細菌內(nèi)毒素檢查法中方法2“光度檢測法”測定樣品中細菌內(nèi)毒素含量。

1.2.7 紫外吸收光譜

將所得木葡聚糖配制成質(zhì)量濃度4 mg/mL 的水溶液，待充分溶解后進行紫外光譜掃描，波長范圍為200～400 nm。

1.2.8 紅外吸收光譜

將所得木葡聚糖與溴化鉀按比例（1∶100） 混勻、研磨、壓片后進行紅外光譜掃描，掃描的范圍為4 000～500 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對羅望子木葡聚糖純度的影響

分別選取料液比為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5（g∶mL），對羅望子木葡聚糖純度的影響。

料液比對羅望子木葡聚糖純度的影響見圖1。

圖1 料液比對羅望子木葡聚糖純度的影響

由圖1 可知，料液比對羅望子木葡聚糖蛋白質(zhì)含量的影響并不顯著，當料液比為1∶2 時，蛋白質(zhì)含量最低，為1.25%。因此，選擇1∶2 為最佳料液比。

2.1.2 酸處理pH 值對羅望子木葡聚糖純度的影響

分別選取酸處理pH 值為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，對羅望子木葡聚糖純度的影響。

酸處理pH 值對羅望子木葡聚糖純度的影響見圖2。

圖2 酸處理pH 值對羅望子木葡聚糖純度的影響

羅望子粗粉中含有大量水溶性蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié)pH 值至蛋白質(zhì)的等電點（Protein isoelectric point，PI），使蛋白質(zhì)溶解性變小，形成容易去除的沉淀物。由圖2 可知，酸處理pH 值對羅望子木葡聚糖蛋白質(zhì)含量的影響較大，隨著pH 值升高，蛋白質(zhì)含量先降低后升高，在pH 值為3.5 時蛋白質(zhì)含量最低，說明大部分帶負電荷的蛋白質(zhì)被去除。因此，選擇pH 值3.5 為最佳酸處理pH 值。

2.1.3 堿處理pH 值對羅望子木葡聚糖純度的影響

分別選取堿處理pH 值為10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，對羅望子木葡聚糖純度的影響。

堿處理pH 值對羅望子木葡聚糖純度的影響見圖3。

圖3 堿處理pH 值對羅望子木葡聚糖純度的影響

由圖3 可知，堿處理pH 值對羅望子木葡聚糖蛋白質(zhì)含量的影響較大，隨著pH 值升高，蛋白質(zhì)含量先降低后升高，在pH 值為12 時達到最低值，說明大部分帶正電荷的蛋白質(zhì)被去除。因此，選擇pH 值12 為最佳堿處理pH 值。

2.2 羅望子木葡聚糖純度正交試驗結(jié)果

為優(yōu)化羅望子木葡聚糖的提取工藝，選取對提取工藝影響最大的3 個因素，每個因素設置3 個水平：料液比（1∶1，1∶2，1∶3）、酸處理pH 值（3.0，3.5，4.0）、堿處理pH 值（11.5，12.0，12.5）進行L9（34）正交試驗。

L9（34）正交試驗結(jié)果與分析見表2。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果與分析

由表2 可知，羅望子木葡聚糖最佳提取工藝為料液比1∶3，酸處理pH 值3.5，堿處理pH 值12.0。通過計算極差可知酸處理pH 值對羅望子木葡聚糖純度的影響最大，其次為堿處理pH 值，而料液比的影響最小。

2.3 驗證性試驗

羅望子木葡聚糖最佳提取工藝正交試驗中，因此需在該條件下再進行驗證試驗：將羅望子多糖粗粉按料液比為1∶3 進行溶解，待樣品溶解后將溶液離心取上清液，得到“羅望子多糖水提液”；向水提液中加入醋酸，調(diào)節(jié)pH 值至3.5，靜置沉降；再取上清液加入氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH 值至12.0，靜置沉降；隨后，取上清液加入活性炭吸附，離心后將上清液裝入50 kDa 透析袋中透析；最后，將透析后的溶液經(jīng)過冷凍干燥得到“精制羅望子木葡聚糖”。

2.3.1 理化指標檢測

經(jīng)檢測精制羅望子木葡聚糖的蛋白質(zhì)含量為0.2%，細菌內(nèi)毒素含量為150 EU/g，總糖含量為99.63%。

2.3.2 紫外吸收光譜檢測

羅望子木葡聚糖的紫外吸收光譜見圖4。

圖4 羅望子木葡聚糖的紫外吸收光譜

由圖4 可知，羅望子多糖水提液于波長260 nm處無吸收峰，但在波長280 nm 處有較大吸收峰，證明該溶液含有大量蛋白質(zhì)。精制羅望子木葡聚糖于波長260 nm 和280 nm 處均無吸收峰，表示樣品中不含有蛋白質(zhì)和核酸，或含量很少，與正交試驗結(jié)果相同。

2.3.3 紅外吸收光譜檢測

羅望子木葡聚糖的紅外吸收光譜見圖5。

圖5 羅望子木葡聚糖的紅外吸收光譜

由圖5 可知。表3 列舉了部分峰的具體峰位置。2 個樣品在3 600～3 200 cm-1處有O-H 伸縮振動的吸收峰，在3 000～2 800 cm-1處有C-H 伸縮振動的吸收峰，以上2 個峰為糖類物質(zhì)的特征吸收峰。同時，2 個樣品在1 380～1 370，1 040～1 030，940，890 cm-1處均有木葡聚糖的特征峰，其中1 380～1 370 cm-1為木葡聚糖中CH2彎曲振動[29]，1 040～1 030 cm-1為木葡聚糖中的C-O-C 伸縮振動，940 cm-1為葡萄糖的環(huán)振動，890 cm-1為葡萄糖和木糖β 端基的鏈接。說明2 個樣品中均含有木葡聚糖。此外，羅望子多糖水提液在1 530 cm-1處有N-H 彎曲振動吸收峰，在1 250 cm-1處有C-N 伸縮振動峰，這2 個峰為蛋白質(zhì)或多肽的特征吸收峰，而在精制羅望子木葡聚糖中不存在這2 個峰，說明經(jīng)最佳提取方案制備的精制羅望子木葡聚糖其純度大幅度提高，而蛋白質(zhì)含量較低，與正交試驗、紫外吸收光譜結(jié)果相似。

表3 羅望子木葡聚糖的紅外測試結(jié)果/ cm-1

羅望子木葡聚糖的紅外測試結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

以羅望子種子為原料，利用羅望子木葡聚糖耐熱、耐酸堿的特性，采用酸、堿處理，結(jié)合活性炭吸附、透析的方法去除多糖中的蛋白質(zhì)，優(yōu)化了羅望子木葡聚糖的提取工藝。在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗分析料液比、酸處理pH 值、堿處理pH 值3 種因素對木葡聚糖純度的影響。試驗結(jié)果表明，該提取工藝的最佳條件為料液比1∶3，酸處理的pH 值3.5，堿處理的pH 值12.0；各因素對木葡聚糖純度影響的大小順序為酸處理pH 值＞堿處理pH 值＞料液比。經(jīng)驗證，在最佳條件下，羅望子木葡聚糖的細菌內(nèi)毒素含量為150 EU/g，總糖含量為99.63%，其蛋白質(zhì)含量大幅度降低，含量為0.2%，與紅外吸收光譜和紫外吸收光譜結(jié)果相類似。通過此工藝提取的木葡聚糖純度較高，為木葡聚糖的提取工藝提供了新思路，也對其在生物醫(yī)藥、醫(yī)用材料、食品、造紙、紡織等領域的應用作出貢獻。