關(guān)鍵詞在線固相萃??；雙重聚焦；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；抗生素；牛奶

復雜體系中樣品的分離分析一直是分析化學的研究重點。對于復雜樣品的分析，盡管現(xiàn)代高效液相色譜（HPLC）具有很高的分離度，樣品前處理過程仍然是最繁瑣和耗時的步驟[1]。固相萃?。⊿PE）是復雜基質(zhì)前處理的常用方法[2]，在線SPE偶聯(lián)HPLC可以簡化分析步驟、提高靈敏度[3-4]，廣泛應用于食品[5-6]、環(huán)保[7-8]和醫(yī)療[9-10]等領域。但是，現(xiàn)有的在線SPE偶聯(lián)HPLC系統(tǒng)接口存在一些局限性[11]，例如強溶劑樣品的直接大體積進樣分析，由于溶劑效應，會使峰展寬，從而導致靈敏度不高[12-14]。因此，需要將強溶劑蒸干后再采用弱溶劑復溶，前處理步驟繁瑣[15-16]。峰聚焦在線SPE偶聯(lián)HPLC系統(tǒng)可以通過稀釋洗脫液實現(xiàn)樣品在分析柱的柱頭聚焦[17-18]，但是無法使樣品在SPE柱柱頭富集，而樣品在SPE柱上的擴散會增加樣品在分析柱柱頭聚焦的難度，造成峰展寬和樣品損失。因此，構(gòu)建一套可以使樣品同時在SPE柱和分析柱柱頭聚焦的在線SPE偶聯(lián)HPLC系統(tǒng)，對復雜樣品的分析具有重要意義。

抗生素作為一種治療畜禽類疾病的藥物，在現(xiàn)代牛奶業(yè)養(yǎng)殖中廣泛使用。如果在奶牛泌乳期過量使用抗生素，可能造成牛奶中抗生素殘留，并通過食物鏈對人體健康造成危害[19]?？股貧埩魴z測通?；诟咝б合嗌V法[20-21]，例如高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）[22]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）[23-24]和高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜（HPLC-HRMS）[25-26]。其中，HPLC-MS/MS法為復雜樣品基質(zhì)中痕量組分的分離、鑒定和定量提供了一種有效的技術(shù)[27]，是抗生素殘留分析的主流檢測方法。目前，結(jié)合在線SPE和HPLC-MS/MS法分析食品中的抗生素殘留已有較多報道[28-31]，但是基于雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS法分析食品中的抗生素殘留尚未見報道。

本研究采用雙在線稀釋法將目標物在SPE柱和分析柱柱頭進行聚焦，構(gòu)建了具有雙重聚焦功能的在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)，解決了強溶劑樣品直接大體積進樣分析中的譜帶展寬問題。將此系統(tǒng)用于牛奶中8種抗生素殘留的分析，建立了一種簡單、快速、高靈敏的牛奶中不同種類抗生素殘留的同時檢測方法，在動物源性食品中抗生素殘留的高靈敏分析中具有良好的應用潛力。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

LC5190高效液相色譜儀（配有2個四元泵、1個二元泵、1個自動進樣器、1個柱溫箱內(nèi)置1個兩位六通閥和LC5s色譜工作站，浙江福立分析儀器有限公司）；TripleQuad?4500質(zhì)譜儀（美國ABSciex公司）；HC-3018R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；DLABMX-S型可調(diào)渦旋混勻儀（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司）；Practum224-1CN型微量電子天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

標準品：四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、強力霉素（DC）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺氯噠嗪（SCP）和磺胺甲噁唑（SMZ）（純度＞98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇和乙腈（HPLC級，美國TEDIA公司）；甲酸（HPLC級，德國Merck公司）；乙二胺四乙酸二鈉二水合物（GR級，美國Aladdin公司）。實驗用水為超純水。牛奶購于當?shù)啬吵小?/p>

1.2標準溶液配制

單標標準儲備液的配制 準確稱取8種抗生素單標標準品各適量，分別用甲醇溶解并定容至10mL，配制成1.0mg/mL的單標標準儲備液，于?20℃避光保存。

混合標準儲備液的配制 分別取四環(huán)素類單標標準儲備液各0.1mL至同一個10mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成10μg/mL的四環(huán)素類混合標準儲備液，于?20℃避光保存；分別量取磺胺類單標標準儲備液各0.1mL至同一個10mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成10μg/mL的磺胺類混合標準儲備液，于?20℃避光保存。

混合標準工作溶液的配制 取0.1mL四環(huán)素類混合標準儲備液至10mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成0.1μg/mL的四環(huán)素類混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；取0.1mL磺胺類混合標準儲備液至10mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成0.1μg/mL的磺胺類混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3樣品前處理

準確稱取2.00g（精確至0.01g）牛奶樣品于50mL離心管中，依次加入0.5mL0.1mol/L的Na2EDTA溶液和7.5mL0.1%甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩1min，搖勻后，10000r/min離心5min，取上清液過0.22μm尼龍濾膜，待測。

1.4在線SPE-HPLC-MS/MS條件

1.4.1在線SPE-HPLC條件

采用SelectCoreHLB（10mm×4.6mm，25μm，納譜分析技術(shù)（蘇州）有限公司）作為在線SPE柱，SunshellC18（150mm×3.0mm，3.5μm，日本ChromanikTechnology公司）作為分析柱，柱溫40℃，進樣量50μL。六通閥切換時間如下：0～2min，六通閥1位和6位相連，此時上樣泵流動相將自動進樣器中的樣品稀釋后加載至在線SPE柱，分析泵流動相平衡分析柱，稀釋泵停泵；2～5min，六通閥的1位和2位相連，分析泵流動相將在線SPE柱中的目標化合物反沖至分析柱，同時稀釋泵流動相對洗脫液進行在線稀釋；5～15min，六通閥1位和6位相連，目標化合物經(jīng)分析柱分離后進行質(zhì)譜檢測，上樣泵流動相沖洗在線SPE柱，稀釋泵停泵。三泵梯度洗脫程序見電子版文后支持信息表S1。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；掃描模式：多反應監(jiān)測模式（MRM）；電噴霧電壓：5500V；離子源溫度：500℃；氣簾氣：30psi（1psi=6.89kPa）；霧化氣壓力：50psi；輔助氣壓力：55psi。8種抗生素的離子對和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2結(jié)果與討論

2.1雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)的構(gòu)建

目前使用的在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)接口通常為1個六通閥，進樣前需要對強溶劑提取液進行溶劑蒸干和復溶，既耗時又降低了準確度。本研究以1個六通閥和2個混合器為接口，采用雙在線稀釋的方法，構(gòu)建雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)，如圖1所示。該系統(tǒng)采用上樣溶劑在第一個混合器中對樣品中的強溶劑進行樣品在線稀釋，提高目標物在SPE柱上的保留和柱頭富集；采用稀釋液在第二個混合器中對洗脫液中的強溶劑進行洗脫液在線稀釋，實現(xiàn)目標物在分析柱頭聚焦。相比于普通在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)，雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢：（1）實現(xiàn)了強溶劑樣品的在線稀釋，省去了溶劑蒸干和復溶步驟；（2）實現(xiàn)了目標物在SPE柱和分析柱柱頭雙重聚焦，改善了色譜峰形及分離性能；（3）系統(tǒng)配置簡單，在普通在線SPE-HPLC-MS/MS的基礎上，只需增加2個混合器和1個稀釋泵，適用于日常分析。

2.2系統(tǒng)性能評價

雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)的主要優(yōu)勢是避免了強溶劑樣品直接大體積進樣而引起的峰展寬和靈敏度降低。因此，本研究通過對比普通在線SPE-HPLC-MS/MS、單聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS（分析柱柱前聚焦和固相萃取柱柱前聚焦）和雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)對色譜峰寬和峰高的影響，評價雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)的性能。與雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)（圖1）相比，普通在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)在圖1結(jié)構(gòu)上去掉2個混合器和稀釋泵，分析柱柱前聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)在圖1結(jié)構(gòu)上去掉第1個混合器，固相萃取柱柱前聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)在圖1結(jié)構(gòu)上去掉第2個混合器和稀釋泵。以2μg/L磺胺甲噁唑標準溶液（溶劑為乙腈-水（4∶1，V/V））為分析對象，按照1.4節(jié)在線SPE-HPLC-MS/MS條件進行分析，結(jié)果如圖2所示，不同在線SPEHPLC-MS/MS系統(tǒng)對磺胺甲噁唑色譜峰寬和峰高影響很大，相比于普通在線SPE-HPLC-MS/MS（圖2A）和單聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)（圖2B和2C），采用本研究構(gòu)建的雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)（圖2D）分析所得到的磺胺甲噁唑色譜峰最窄且最高。

2.3雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

選擇合適的在線SPE柱、上樣溶劑、洗脫溶劑、洗脫時間、洗脫流速以及稀釋流速是雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS方法的關(guān)鍵。SelectCoreHLB柱為親水親脂型填料的固相萃取柱，具有親水性和疏水性基團，通過親水或疏水相互作用力，可以保留多種極性差異較大的化合物，常用于抗生素固相萃取[32]，本研究選擇SelectCoreHLB柱作為在線SPE柱。上樣溶劑既用于加載樣品，又用于稀釋樣品中的強溶劑。通常，上樣溶劑中水溶液比例越高，稀釋效果越好，目標物在SPE柱上的保留越強，但是也會增強樣品基質(zhì)的保留。本研究選擇5%甲醇為上樣溶劑，在保證目標物富集的同時，清洗部分極性較大的雜質(zhì)。為了快速有效地將SPE柱上的目標物洗脫下來，選擇乙腈-0.1%甲酸（30∶70，V/V）溶液為洗脫液。由于洗脫液和稀釋液同時進入分析柱，高流速易造成系統(tǒng)壓力過高，因此選擇合適的洗脫流速和稀釋流速尤為重要。本研究選擇洗脫流速為0.2mL/min，稀釋流速為0.4mL/min，可以在保證壓力穩(wěn)定的同時實現(xiàn)目標物在分析柱柱頭的聚焦。

以0.5μg/L混合標準溶液為分析對象，考察目標物的洗脫時間，以便準確設定閥切換時間。以乙腈-0.1%甲酸（30∶70，V/V）溶液為洗脫液，洗脫流速為0.2mL/min，將流路中的分析柱、稀釋泵和第2個混合器拆去，以兩通替代，分析泵將目標物從SPE柱上洗脫下來后直接進入質(zhì)譜分析，可以獲得目標物的洗脫時間約為3min（圖3）?；谏鲜鰯?shù)據(jù)，設定閥切換時間為2～5min，可有效保證目標物均能轉(zhuǎn)移至分析柱。

2.4方法學考察

2.4.1基質(zhì)效應

基質(zhì)效應（Matrixeffect，ME）是在LC-MS/MS分析過程中，樣品基質(zhì)中的共提干擾物對目標化合物的離子化效率產(chǎn)生影響，使目標物的信號增強或被抑制，從而影響分析結(jié)果的準確性[33]。本研究采用空白樣品基質(zhì)中標準溶液的信號強度（A）與純?nèi)軇┲邢嗤瑵舛葮藴嗜芤盒盘枏姸龋˙）的比值評價基質(zhì)效應，即ME=A/B×100%。ME=100%表示不存在基質(zhì)效應，80%150%為強基質(zhì)效應[34]。實驗結(jié)果表明，4種磺胺類抗生素為弱基質(zhì)效應，4種四環(huán)素類抗生素存在中等基質(zhì)效應?？紤]到基質(zhì)效應無法徹底消除，因此，本研究采用空白樣品基質(zhì)匹配標準溶液建立標準曲線以達到在一定程度上消除基質(zhì)效應的目的，提高檢測結(jié)果的準確性。

2.4.2線性范圍、檢出限和定量限

向空白牛奶中添加低、中、高3個不同濃度水平的抗生素標準溶液，濃度以磺胺類和四環(huán)素類定量限的1、2和10倍確定，分別為0.1/0.2、0.2/0.4和1.0/2.0μg/kg，按照1.3節(jié)的方法處理后再進行測試，每個濃度平行測定6次。加標回收率和相對標準偏差（RSD）見表3，8種抗生素的回收率為80.6%～103.9%，RSD為0.3%～13.5%，結(jié)果均符合國標（GB/T27404—2008）[35]相關(guān)要求。

2.5實際樣品分析

采用本方法對市售的10種不同品牌純牛奶樣品中的8種抗生素進行檢測，結(jié)果見表4。磺胺甲基嘧結(jié)果說明，被檢牛奶中存在一定的抗生素污染，但是均未超過我國獸藥殘留的最高限量標準（磺胺類總量限量為100μg/kg，四環(huán)素類（土霉素、金霉素、四環(huán)素）總量限量為100μg/kg，強力霉素泌乳期禁用）[36]。

標準品和牛奶樣品的色譜圖如圖4所示，在抗生素的保留時間附近未見來自牛奶樣品的顯著干擾，并且抗生素的所有峰均尖銳且對稱。

2.6與文獻方法對比

與文獻報道的測定磺胺類與四環(huán)素類的在線SPE方法相比（表5），在定量限相當?shù)那闆r下，本方法的前處理只需進行蛋白沉淀，省去了溶劑蒸干和復溶步驟，前處理更簡單；在前處理都只進行蛋白沉淀的情況下，定量限較文獻方法低。因此，本方法可以同時滿足前處理簡單和定量限低的要求。

3結(jié)論

采用雙在線稀釋方法構(gòu)建了雙重聚焦在線SPE-HPLC-MS/MS系統(tǒng)，實現(xiàn)了強溶劑樣品的直接大體積進樣分析，既省去了溶劑蒸干和復溶步驟，又提高了檢測的靈敏度。將本方法應用于牛奶樣品中8種抗生素殘留的分析，結(jié)果令人滿意。本方法前處理簡單，靈敏度高，可用于復雜樣品分析。