郭春敏,張 紅,田付港,于 昕

(煙臺大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺,264005)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是世界第二大神經(jīng)退行性疾病,其臨床表現(xiàn)包括震顫、行動遲緩、姿勢不穩(wěn)等運動癥狀及嗅覺損傷、認(rèn)知減退、抑郁等非運動癥狀,其中嗅覺障礙作為PD典型的非運動癥狀在PD患者中的發(fā)病率高達(dá)90%[1-2],但其發(fā)病機制尚不清楚,研究表明其可能涉及神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂、α-syn異常聚集、神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)等[3]。目前臨床上對PD嗅覺障礙的治療尚無明確的指導(dǎo)藥物,僅局限于嗅覺訓(xùn)練、深部腦刺激等物理方法[4]。有文獻(xiàn)報道,多巴胺(Dopamine,DA)受體激動劑可以改善PD大鼠的嗅覺障礙,但其具體作用機制均未被探討[5-6]。羅替戈汀(Rotigotine)作為D3D2D1受體激動劑,是治療原發(fā)性帕金森病運動癥狀的一線藥物。Rotigotine長鏈酯(Rotigotine long chain ester,RLCE)是一種長效微晶制劑,進(jìn)入體內(nèi)可實現(xiàn)28～30 d持續(xù)穩(wěn)定釋放Rotigotine。因此,本實驗通過腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6,-四氫吡啶(1-methy1-4-pheny1-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)制作PD小鼠模型,評價RLCE對PD嗅覺障礙的改善作用,同時在α-syn的聚集和神經(jīng)炎癥等方面探討其可能的作用機制,為PD嗅覺障礙的治療提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雄性SPF級C57BL/6小鼠,50只,8～10周齡,質(zhì)量20～25 g,濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物許可證號:SCXK(魯)20190003,質(zhì)量合格證流水號:370726211101063435。小鼠飼養(yǎng)在山東綠葉實驗動物中心SPF級屏障飼養(yǎng)環(huán)境,室溫保持(23 ± 2)℃,墊料每周更換一次,自由飲水及采食,人工照明12 h/12 h明暗交替。本研究經(jīng)過煙臺大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

RLCE,山東綠葉制藥有限公司生產(chǎn);MPTP,批號:L2031451(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);GTVision TMIII 型免疫組化檢測試劑盒(含DAB),(上?；蚩萍脊煞萦邢薰?;TH抗體、GFAP抗體、IBA1抗體、iNOS 抗體(CST); β-actin 抗體(小鼠單抗)、BCA 濃度測定試劑盒(增強型)、酶標(biāo)山羊抗兔 IgG、山羊抗鼠 IgG (碧云天生物技術(shù)公司)。

1.3 儀器

離心機(上海貝克曼庫爾特有限公司); 酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司); 全自動化學(xué)發(fā)光成像凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司); 石蠟切片機(上海賽默飛世爾科技有限公司); Vectra3定量病理成像分析系統(tǒng)(上海珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司)。

2 方 法

2.1 實驗分組與造模

C57(每組10只,全雄)小鼠隨機分為正常組,模型組,RLCE低(11.2 mg·kg-1)、中(22.4 mg·kg-1)、高(44.8 mg·kg-1)劑量組。根據(jù)文獻(xiàn)報道的劑量和方法[7],結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果,模型組及給藥組小鼠以0.1 mL/10 g的給藥體積連續(xù)腹腔注射MPTP(25 mg·kg-1) 28 d,正常組小鼠給予等體積的生理鹽水。于MPTP造模前48 h對給藥組小鼠以0.05 mL/10 g的給藥體積單次肌肉注射RLCE,正常組與模型組小鼠給予等劑量的1% CMC-Na,并于給藥后26～30 d進(jìn)行行為學(xué)觀察。

2.2 行為學(xué)實驗

2.2.1 埋丸實驗 埋丸實驗檢測小鼠的嗅覺識別能力[8]。將食物顆粒埋藏在干凈的玉米墊料下0.5 cm處,小鼠進(jìn)入鼠盒時開始計時。記錄小鼠尋找食物顆粒的時間,若5 min找不到即記為300 s,允許小鼠找到食物顆粒后吃完作為獎勵。實驗連續(xù)進(jìn)行3 d,取三次平均值進(jìn)行統(tǒng)計;第四天將食物顆粒放在墊料表面,記錄各組小鼠尋找食物顆粒的時間,以排除各組小鼠因缺乏動機造成的差異。

2.2.2 木塊實驗 以木塊實驗檢測小鼠嗅覺辨別能力[8]。準(zhǔn)備實驗?zāi)緣K2 cm×2 cm×2 cm,放入裝有雌鼠籠墊料的袋子內(nèi),室溫放置24 h。實驗時,試驗區(qū)域分別放置帶有雌性小鼠的氣味的木塊和不作任何處理的空白木塊。在實驗區(qū)域的正中央放入實驗鼠,錄像5 min,統(tǒng)計小鼠嗅聞目標(biāo)木塊(帶有雌性小鼠氣味)的時間與空白木塊的時間。計算小鼠的識別指數(shù):

2.3 Western Blot 實驗

每組隨機取3只小鼠,斷頸,心臟灌流,分離嗅球。RIPA裂解,超聲,15 000 r·min-1離心15 min,BCA法配置蛋白,以每孔50 μg的上樣量進(jìn)行蛋白電泳,轉(zhuǎn)膜,常溫牛奶孵育2 h,一抗4 ℃過夜處理,次日二抗常溫孵育2 h,采用ECL顯影液顯影。Image J 2.0軟件進(jìn)行分析,相對積分光密度(IDO)比值表示結(jié)果。

2.4 免疫組化法檢測小鼠黑質(zhì)及嗅球TH的表達(dá)

每組隨機取3只小鼠,斷頸,采用4 %多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注,取腦,4 ℃固定24 h。腦組織脫水固定,按照免疫組化試劑盒中的步驟進(jìn)行染色并封片。Vectra3定量病理成像系統(tǒng)拍攝圖片,Image J 2.0軟件進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠的狀態(tài)和數(shù)量觀察

給予MPTP 30 min后小鼠均出現(xiàn)震顫、行動遲緩、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、弓背、豎毛等情況。且在造模后期進(jìn)行的行為學(xué)試驗中,模型組表現(xiàn)出明顯的嗅覺障礙,造模期間小鼠無死亡情況發(fā)生。RLCE治療后PD小鼠的震顫、行動遲緩、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、弓背、豎毛現(xiàn)象得到改善。

3.2 RLCE對PD小鼠嗅覺障礙的影響

如圖1所示,第1～3天的實驗中,與正常組相比,模型組小鼠尋找食物顆粒的時間顯著延長(###P<0.001),提示模型組小鼠出現(xiàn)了嗅覺察覺功能障礙;與模型組相比,RLCE各給藥組小鼠尋找食物顆粒的時間顯著降低(**P<0.01),結(jié)果表現(xiàn)出劑量依賴,提示RLCE改善了PD小鼠的嗅覺察覺功能障礙。第4天的實驗中各組小鼠尋找食物顆粒的時間無顯著性差異,因此排除小鼠因缺乏動機造成的實驗結(jié)果的差異。

圖1 埋丸實驗結(jié)果

如圖2所示,與正常組相比,模型組小鼠對目標(biāo)木塊的識別指數(shù)顯著降低(##P<0.01),說明模型組小鼠嗅覺辨別功能發(fā)生障礙;與模型組相比,RLCE各給藥組小鼠對目標(biāo)木塊的識別指數(shù)顯著提高(*P<0.05,**P<0.01),結(jié)果表現(xiàn)出劑量依賴性,提示RLCE改善了PD小鼠的嗅覺辨別能力。

圖2 木塊實驗結(jié)果

3.3 RLCE對PD小鼠嗅球及黑質(zhì) TH 表達(dá)的影響

如圖3所示,與正常組比較,模型組黑質(zhì)TH神經(jīng)元的表達(dá)量顯著降低(##P<0.01),與模型組相比,RLCE各給藥組黑質(zhì)TH神經(jīng)元的表達(dá)量均顯著增多(**P<0.01),結(jié)果表現(xiàn)出劑量依賴,說明RLCE對PD小鼠黑質(zhì)的TH神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

圖3 各組小鼠黑質(zhì)TH神經(jīng)元的表達(dá)情況

如圖4所示,與正常組比較,模型組嗅球的TH神經(jīng)元的表達(dá)量顯著升高(##P<0.01),與模型組相比,RLCE各給藥組嗅球TH神經(jīng)元的表達(dá)量均顯著下降(**P<0.01),結(jié)果表現(xiàn)出劑量依賴,說明RLCE可抑制PD小鼠的TH神經(jīng)元在嗅球內(nèi)的異常增多。

圖4 小鼠嗅球TH神經(jīng)元的表達(dá)情況

3.4 RLCE對PD小鼠嗅球蛋白表達(dá)的影響

3.4.1 RLCE對PD小鼠嗅球α-syn及P-α-syn表達(dá)的影響 如圖5所示,Western Blot 實驗結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組小鼠嗅球α-syn、P-α-syn的表達(dá)量顯著提高(##P< 0.01);與模型組相比,各給藥組小鼠α-syn、P-α-syn的表達(dá)量顯著降低(**P<0.01)。圖6的免疫組化結(jié)果表明,模型組嗅球α-syn、P-α-syn的表達(dá)量顯著提高,RLCE給藥顯著降低了嗅球α-syn、P-α-syn的表達(dá),結(jié)果提示RLCE可以顯著抑制PD小鼠嗅球α-syn的聚集及磷酸化。

圖5 小鼠嗅球α-syn及P-α-syn蛋白表達(dá)情況

圖6 小鼠嗅球α-syn及P-α-syn蛋白表達(dá)情況

3.4.2 RLCE對PD小鼠嗅球炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖7所示,與正常組相比,模型組小鼠嗅球IBA1、GFAP、iNOS的表達(dá)量顯著提高(##P<0.01),與模型組相比,各給藥組IBA1、GFAP、iNOS的表達(dá)量顯著降低(**P<0.01),表現(xiàn)出劑量依賴,說明RLCE可顯著降低PD小鼠嗅球內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

圖7 小鼠嗅球IBA1、GFAP和iNOS蛋白的表達(dá)情況

4 討 論

PD是一種好發(fā)于老年人的神經(jīng)退行性疾病,主要病理表現(xiàn)為黑質(zhì)DA神經(jīng)元缺失以及紋狀體神經(jīng)末梢退行性變,但PD的病理改變并不局限于黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng),BRAAK等提出PD的標(biāo)志性蛋白α-syn在PD早期首先出現(xiàn)在嗅球以及前嗅核[9],因此嗅覺功能障礙是PD 疾病進(jìn)展中最早發(fā)生的非運動癥狀之一。Rotigotine是典型的DR受體激動劑,能有效改善PD運動癥狀,但其在PD嗅覺障礙中的應(yīng)用未被明確探討。本研究評價RLCE對PD小鼠嗅覺障礙的改善作用,同時在α-syn的聚集和神經(jīng)炎癥等方面探討其可能的作用機制,為PD嗅覺障礙的治療提供實驗依據(jù)。

MPTP及其代謝產(chǎn)物通過損害線粒體電子傳遞鏈,導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生,誘導(dǎo)DA神經(jīng)元凋亡,從而產(chǎn)生類PD樣癥狀和病理特征[10],研究證實,MPTP可以誘導(dǎo)C57小鼠出現(xiàn)嗅覺障礙[11]。行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組小鼠尋找食物顆粒的時間顯著延長,對目標(biāo)木塊的識別指數(shù)顯著下降,表明模型小鼠的嗅覺功能明顯降低,證實動物模型已成功構(gòu)建。此外,給予RLCE可以明顯改善PD小鼠的嗅覺功能,且具有劑量依賴性,表明RLCE對PD嗅覺障礙具有治療作用。

TH是DA合成的限速酶,黑質(zhì)內(nèi)DA神經(jīng)元丟失、TH神經(jīng)元活性下降是PD的病理標(biāo)志[12]。黑質(zhì)的DA神經(jīng)元可直接投射到嗅球的球周細(xì)胞層(GL),介導(dǎo)嗅覺感知。有研究發(fā)現(xiàn),PD患者嗅球內(nèi)TH可增加到原來的兩倍,認(rèn)為可能是對黑質(zhì)DA能神經(jīng)元丟失的代償反應(yīng)[13],且該過程可能與嗅覺障礙有關(guān)。本研究對黑質(zhì)和嗅球進(jìn)行了TH神經(jīng)元的免疫組化染色,結(jié)果表明RLCE可增加黑質(zhì)內(nèi)TH神經(jīng)元數(shù)量,降低嗅球GL內(nèi)TH神經(jīng)元的表達(dá),說明RLCE可通過增加PD小鼠中腦黑質(zhì)TH神經(jīng)元的數(shù)量,來抑制嗅球內(nèi)TH神經(jīng)元的代償性增加。該結(jié)果可以解釋RLCE對PD嗅覺障礙的改善作用。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)在PD的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。研究表明,嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)對炎癥因素存在易感性,而α-syn在神經(jīng)元中的異常聚集是神經(jīng)炎癥的主要刺激因素,一方面表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常活化,導(dǎo)致固有免疫系統(tǒng)異常,增加對受損神經(jīng)元的攻擊;另一方面活化的小膠質(zhì)細(xì)胞對α-syn降解效率顯著下降,進(jìn)一步促進(jìn)α-syn的聚集[14],加重嗅覺障礙病理。IBA1是一種小膠質(zhì)細(xì)胞特異性鈣結(jié)合蛋白,是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)記[15]。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的標(biāo)志,活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞會激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生NO,從而激活炎癥反應(yīng)[16]。實驗結(jié)果表明,RLCE給藥可降低嗅球α-syn、P-α-syn以及IBA1、GFAP、iNOS的表達(dá),說明RLCE可抑制嗅球內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,降低炎癥反應(yīng),且該過程可能與其降低α-syn的聚集及磷酸化互為因果。

5 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明,RLCE可以改善PD小鼠的嗅覺障礙,該過程可能與RLCE抑制PD小鼠嗅球內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,降低嗅球內(nèi)的炎癥反應(yīng),減少α-syn的聚集及磷酸化,并降低嗅球內(nèi)TH的代償性增加有關(guān)。