張挺

（廣州城市職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510405）

近年來，食品安全問題已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人類的健康，而果蔬中由于過量使用或?yàn)E用農(nóng)藥而導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留及其急慢性中毒已經(jīng)引起了社會(huì)的高度重視。目前，我國(guó)常用的有機(jī)磷，氨基甲酸酯類農(nóng)藥如甲胺磷、對(duì)硫磷、馬拉硫磷、樂果等幾十種高毒農(nóng)藥占總農(nóng)藥用量的70%以上。對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有色譜分析法[1-3]、酶免疫技術(shù)[4、5]、生物技術(shù)、酶抑制法[6-8]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳等方法，但傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)、繁瑣、成本高。本文研究的酶制劑抑制法是一種簡(jiǎn)便、靈敏、快速、成本低廉的檢測(cè)方法，特別適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及大批量樣品的篩選，尤其適合集體食堂和賓館、飯店等采購員使用，保證蔬菜食用的安全性。

一、研究方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.實(shí)驗(yàn)材料

（1）試劑

鹽酸、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、碘化硫代乙酰膽堿、5,5`-二硫雙(2-硝基苯甲酸) (DTNB)均為分析純?cè)噭?/p>

丙酮色譜純?cè)噭粺o水硫酸鈉；磷酸鹽緩沖溶液（15.0 g 磷酸氫二鉀與1.59 g 無水磷酸二氫鉀500 mL 蒸餾水溶解）；甲胺磷、毒死蜱均購于國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心；農(nóng)藥速測(cè)卡，廣州天河綠洲生物化學(xué)研究中心；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液：有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和丙酮配制成儲(chǔ)備液（1000 μg/mL），置于冰箱中；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)使用液：水稀釋農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液使?jié)舛确謩e為1、3、5μg/mL 的使用液，體積1000 mL。

（2）食品材料

烏魚、黃鱔、草魚、塘鲺和豆角購于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)三角市菜市場(chǎng)，底物和顯色劑由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室提供。

2.實(shí)驗(yàn)儀器

6890GC氣相色譜儀，美國(guó)Aglient公司；HR2838/39搗碎機(jī)，PHLIPS 家用電器公司；752 型紫外光柵分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-5 型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LGJ-10N 冷凍干燥機(jī)，北京亞星儀科科技有限公司。

（二）檢測(cè)方法

1.膽堿酯酶制劑的制備及保藏

試驗(yàn)配制0.2 mol/L 的三羥甲基氨基甲烷溶液和0.1mol/L 鹽酸溶液，分裝于棕色瓶中。用時(shí)再將兩者按一定比例配成pH 為8.2 的緩沖液作為膽堿酯酶的提取液。

將魚背肉洗凈，取背肉，稱量，置于搗碎機(jī)中并加一定量的4℃的提取液，搗成勻漿。將勻漿置于離心機(jī)中，4000 r/min 離心10 min，取上清液即膽堿酯酶提取液，于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥成粉，平均分裝到6 至8 個(gè)離心管中，用錫紙包裹，避光分別放置于-18℃、4℃、干燥器中室溫下保藏。

2.底物和顯色劑的保藏

將底物溶液和顯色劑溶液避光存放并分別置于4℃、干燥器中室溫下保藏，通過酶與底物和顯色劑的反應(yīng)，于420 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，根據(jù)吸光值的變化反映底物和顯色劑的穩(wěn)定性。

3.酶制劑活力的測(cè)定

往裝有膽堿酯酶酶粉的離心管中加入4 mL 蒸餾水，取酶液50μL，用2.8 mL Tris-HCl 緩沖液稀釋后，加入25μL 75 mmol/L 的碘化硫代乙酰膽堿溶液，然后再加入25μL 20 mmol/L 5,5`-二硫雙(2-硝基苯甲酸) 溶液，記錄時(shí)間，在420 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。每隔10 d 測(cè)一次不同保藏條件下的酶活力，每個(gè)樣品測(cè)五次，取其平均值。酶活力以膽堿酯酶與底物和顯色劑反應(yīng)5 min 時(shí)420 nm 波長(zhǎng)下的OD.值表示，酶活力下降百分率公示為：

4.酶制劑測(cè)定豆角中有機(jī)磷農(nóng)藥

試驗(yàn)稱取150.00 g 豆角三份，分別放入體積為1000mL 濃度為1、3、5 μg/mL 的甲胺磷（毒死蜱同）水溶液中，浸泡1 h，撈出瀝干，裝入保鮮袋中冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩７Q取預(yù)處理豆角樣品可食用部分2.00 g，切碎置于小燒杯中，加5 mL 水，浸泡2 min，洗脫液即樣液置于燒杯中備用。吸取樣液2 mL，加入酶制劑試管中，再加2 mL 蒸餾水，搖勻；加底物，振搖2 min；加顯色劑，搖勻，靜置5 min；于420 nm 波長(zhǎng)下測(cè)讀反應(yīng)液在5、8、10 min 的OD.值，并計(jì)算抑制率[9、10]。

空白樣的測(cè)定，取出一根酶管，加入4 mL 蒸餾水，搖勻，加入底物，振搖2 min，再加入顯色劑，搖勻，放置5 min，于420 nm 波長(zhǎng)測(cè)定反應(yīng)液在5min、8min、10min 的吸光度。

5.氣相色譜法檢測(cè)豆角樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥

樣液制備與 “4.酶制劑測(cè)定豆角中有機(jī)磷農(nóng)藥” 方法相同，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11]。色譜柱：DB-1701 14%-氰丙基苯-86%二甲基硅氧烷共聚物型毛細(xì)管柱；長(zhǎng)度：30 m；內(nèi)徑：0.32 mm；膜厚：0.25μm；載氣：N2；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣方式：脈沖不分流進(jìn)樣，60 mL/min，0.75 min；進(jìn)樣方式：自動(dòng)；進(jìn)樣體積：1μL；檢測(cè)器：FPD；溫度：250℃；尾吹氣：60 mL/min；空氣流量：110 mL/min；氫氣流量：150 mL/min；爐初始溫度：100℃；初始時(shí)間：0 min；升溫速率：20 ℃/ min；最后溫度：230 ℃；保留時(shí)間：3 min，即100℃～230 ℃（20℃/ min，保留3 min）。

根據(jù)儀器靈敏度配制一系列不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液。將各濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液2μL～5μL分別注入氣相色譜儀中，測(cè)得不同濃度有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，繪制有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)取樣品溶液2μL～5μL 。分別注入氣相色譜儀中，由測(cè)得的峰面積從標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出相應(yīng)的農(nóng)藥含量。

6.酶制劑定性檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥

測(cè)定甲胺磷溶液濃度分別為0.165、0.385、0.540、0.780、2.015、3.015 mg/kg，和毒死蜱溶液濃度分別為0.100、0.140、0.365、0.405、0.585 mg/kg；將上述不同濃度的農(nóng)藥溶液分別加入酶管中，搖勻；加底物，振搖2 min；加顯色劑，搖勻，放置；觀察在3 min、5 min、8 min 的顏色變化。與空白實(shí)驗(yàn)管對(duì)照，反應(yīng)液顏色為黃綠色或黃色，說明酶被有機(jī)磷農(nóng)藥抑制，判斷為陽性(+)；反應(yīng)液顏色為紫紅色或淺紫紅色，說明酶未被有機(jī)磷農(nóng)藥抑制，判斷為陰性(-)。

7.農(nóng)藥速測(cè)卡檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥

取3 片農(nóng)藥速測(cè)卡，把制備好的樣液滴到白色藥片上，靜置10 min；將速測(cè)卡對(duì)折，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)[12]，捏3 min；與空白實(shí)驗(yàn)對(duì)照[13]，酶被有機(jī)磷農(nóng)藥抑制 (白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色) 為陽性(+)，未抑制(白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對(duì)照相同)為陰性(-)。

二、結(jié)果與分析

（一）保藏過程中膽堿酯酶的活性變化

制備獲得4 種魚的膽堿酯酶，測(cè)定其活力，在0 min～7 min 反應(yīng)的活性的高低順序?yàn)椋簽豸~的膽堿酯酶＞草魚的膽堿酯酶＞塘鲺的膽堿酯酶＞黃鱔的膽堿酯酶，其中烏魚的膽堿酯酶和黃鱔的膽堿酯酶與底物和顯色劑反應(yīng)5 min 后趨于平緩（圖1），酶活性無多大變化。

圖1 凍干前4 種魚的膽堿酯酶的活性變化

4 種魚的膽堿酯酶活力在-18℃下保藏20 d，活力在一定程度上有所增加（圖2），之后活力下降，至保藏的40 d，活力下降幅度在6.23%～31.34%之間（見表1），其中以黃鱔的膽堿酯酶酶活力下降幅度最低其次是烏魚，但是烏魚的膽堿酯酶酶活力較高。

表1 4 種魚的膽堿酯酶酶活性在保藏中的下降百分比

圖2 膽堿酯酶酶制劑于-18℃下保藏過程中活力變化

在不同保藏條件下，對(duì)比了黃鱔的膽堿酯酶活力變化，實(shí)驗(yàn)表明冷藏和冷凍保藏對(duì)酶活力影響較小。冷藏和冷凍保藏條件下，前20 d 內(nèi)隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，膽堿酯酶酶活力的保持較好，且活力測(cè)定值比之前高；20 d 之后酶活力逐漸緩慢下降。在室溫和干燥器中保藏，前20 d 保藏于干燥器中的膽堿酯酶酶活力變化比室溫下保藏的酶活力略高(見表2)。

表2 保存于不同條件下黃鱔膽堿酯酶酶活力的OD.值變化

（二）底物和顯色劑保存的穩(wěn)定性

底物和顯色劑于4℃、干燥器和室溫下保藏40 d，三種保藏條件下的底物和顯色劑的穩(wěn)定性都有所降低，表現(xiàn)為所測(cè)得的膽堿酯酶酶活力不斷下降。其中，保藏于4℃下的底物和顯色劑的測(cè)定酶活力降低15.60%，穩(wěn)定性最好；干燥器中和室溫下保藏下酶活力分別降低25.31%和28.40%（見表3）。

表3 不同保藏條件下底物和顯色劑與酶反應(yīng)的OD.值變化

（三）酶制劑法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的準(zhǔn)確性

通過對(duì)比表4 中對(duì)浸泡豆角的農(nóng)藥殘留酶抑制法分析和表5 中對(duì)純農(nóng)藥的酶抑制法分析的吸光值和抑制率，1μg/mL 甲胺磷浸泡的豆角樣品檢測(cè)的抑制率下降率為11.40%，1μg/mL 毒死蜱浸泡的豆角樣品檢測(cè)的抑制率下降率為15.58%，表明同一農(nóng)藥同一濃度的吸光值隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大（抑制率減?。?；甲胺磷檢測(cè)的抑制率下降率為4.50%～11.40%，毒死蜱檢測(cè)的抑制率下降率為8.70%～15.58%，表明同一農(nóng)藥不同濃度的吸光值隨濃度增大而減?。ㄒ种坡试龃螅?。通過酶抑制法和氣相色譜法測(cè)定樣品中殘留農(nóng)藥的吸光值和抑制率，酶抑制法測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥其分析檢測(cè)結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定結(jié)果相接近，酶抑制法測(cè)定農(nóng)藥殘留有較高的準(zhǔn)確度。

表4 用提純酶液測(cè)定豆角樣品中殘留農(nóng)藥的吸光值和抑制率

表5 提純酶液測(cè)定豆角樣品實(shí)際所含純農(nóng)藥的吸光值和抑制率

（四）酶抑制法定性檢查分析

通過酶制劑定性檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥和農(nóng)藥速測(cè)卡檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷，結(jié)果顯示（如表6 所示），本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的靈敏度根據(jù)農(nóng)藥種類的不同而不同，實(shí)驗(yàn)中甲胺磷的檢出限為0.10 mg/kg，毒死蜱的檢出限為0.20 mg/kg，范圍一般在0.08mg/kg～0.20 mg/kg 之間。而速測(cè)卡的檢測(cè)靈敏度要比酶抑制法的靈敏度低（見表7），甲胺磷的檢出限為0.40mg/kg，毒死蜱的檢出限為0.40 mg/kg，范圍在0.10mg/kg～10 mg/kg 之間。實(shí)驗(yàn)表明酶抑制法比速測(cè)卡法對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)靈敏度高，更為準(zhǔn)確。

表6 氣相色譜法檢測(cè)豆角中農(nóng)藥殘留結(jié)果

表7 酶抑制法和速測(cè)卡法靈敏度檢測(cè)對(duì)比（顯色判斷）

三、結(jié)論

本文通過對(duì)烏魚、草魚、塘鲺和黃鱔4 種魚肉提取的膽堿酯酶在不同保藏條件下的活力分析，表明該酶制劑在4℃以下冷藏或凍藏其活力保存較穩(wěn)定，保藏20 d 內(nèi)酶活力略有升高，保藏30 d 活力下降為6.23%～31.34%；底物和顯色劑在4 ℃下保藏對(duì)酶抑制法檢測(cè)結(jié)果影響較小。本文中膽堿酯酶抑制法，其檢測(cè)農(nóng)殘濃度的準(zhǔn)確度比氣相色譜法測(cè)定準(zhǔn)確度稍低，對(duì)甲胺磷和毒死蜱的檢出限分別為0.10 mg/kg 和0.20 mg/kg，對(duì)豆角樣品農(nóng)殘濃度測(cè)定值的絕對(duì)誤差值在0～0.029 mg/kg，相對(duì)誤差值在0～17.6%，同種農(nóng)藥抑制率下降值的絕對(duì)誤差值非常接近，差值僅為0.5%～1.0%；酶抑制法對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品的農(nóng)殘檢出限為0.2 mg/kg，實(shí)驗(yàn)中農(nóng)藥速測(cè)卡對(duì)甲胺磷和毒死蜱的檢出限均為0.40 mg/kg，酶抑制法檢測(cè)限低，且較為穩(wěn)定和準(zhǔn)確。綜上，本文研究的膽堿酯酶抑制法測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留對(duì)實(shí)際樣品大量篩查檢測(cè)具有一定借鑒作用。