張莎莎，馮翔，高健

河南省兒童醫(yī)院（鄭州兒童醫(yī)院）檢驗科，河南鄭州 450000

愛普斯坦-巴爾病毒（epstein-barr virus, EBV）感染是一種常見的病毒感染，特別是在兒童和青少年中[1]。雖然大多數(shù)感染者無明顯癥狀且通常在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)自行康復(fù)，但少數(shù)患兒會出現(xiàn)嚴(yán)重的干擾素綜合癥、傳染性單核細(xì)胞增多癥和淋巴增殖性疾病等。這些嚴(yán)重的并發(fā)癥會對患兒造成嚴(yán)重負(fù)面影響，可能會導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)的失控和免疫反應(yīng)異常，例如淋巴增殖性疾病與傳染性單核細(xì)胞增多癥導(dǎo)致的肝脾腫大[2-3]。輔助性T 細(xì)胞（helper T cell, Th）1 與Th2 型細(xì)胞是機體免疫系統(tǒng)中至關(guān)重要的兩個亞群，分別以產(chǎn)生干擾素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和白細(xì)胞介素-4（interleukin-4, IL-4）為代表。在EB 病毒感染過程中，機體內(nèi)Th1/Th2 型細(xì)胞的平衡可能發(fā)生改變，從而導(dǎo)致免疫反應(yīng)的不同類型和強度[4]?；诖?，本研究選取2022 年1 月—2023 年1 月河南省兒童醫(yī)院（鄭州兒童醫(yī)院）收治的EBV 感染患兒64 例作為研究對象，通過檢測不同病毒載量的EBV 感染患兒的Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物表達水平變化，分析EBV 感染與Th1/Th2 平衡的關(guān)系，為深入探究EBV 感染的免疫學(xué)機制、評估感染嚴(yán)重程度提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的EBV 感染患兒64 例，并納入EBV 組，另外納入64 例健康兒童作為健康組。EBV組年齡1～7 歲，平均（4.63±1.30）歲；男38 例，女26例。健康組年齡1～6 歲，平均（4.58±1.07）歲；男36例，女28 例。統(tǒng)計EBV 組患兒EBV-DNA 載量，根據(jù)中位水平（8.23×103拷貝）將EBV 組分為高EBV組（n=31）和低EBV 組（n=33），其中高EBV 組年齡（4.45±1.50）歲；男18 例，女13 例。低EBV 組年齡（4.77±1.05）歲；男20 例，女13 例。EBV 組與健康組、高EBV 組與低EBV 組間的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（20210123 號）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合臨床中對于EBV 感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]患兒；②入組前未接受相關(guān)免疫調(diào)節(jié)治療患兒；③患兒家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤者；②EBV-DNA＜1×103拷貝/mL 者；③合并心臟、肝臟、腎臟等器官嚴(yán)重功能不全者。

1.3 方法

①EBV-DNA 定量檢測：患兒入院時，采集靜脈血3 mL，3 000 r/min 離心10 min，取50 μL 血漿，加入50 μL 核酸提取液，振蕩混勻15 s，干浴10 min后，以12.5 cm 的離心半徑1 500 r/min 離心10 min，取上清液，并置于枸櫞酸鈉抗凝管中，采用熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測EBV-DNA 載量；BamH1-W 正向引物：5-GCCAGAGGTAAGTGGACTTT-3，反向引物：5-TACCACCTCCTCTTCTTGCT-3，長度389 bp；熒光探針序列：5-CACACCCAGGCACACACTACACAT-3，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進行操作，以≥1×103拷貝為陽性。②Th1 與Th2 型細(xì)胞檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法對上清液中的IFN-γ、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2, IL-2）、IL-4、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）進行檢測，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進行操作。③Th1/Th2：通過流式細(xì)胞術(shù)測量Th1 細(xì)胞和Th2 細(xì)胞的數(shù)量，并計算Th1/Th2比值。

1.4 觀察指標(biāo)

比較兩組的Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6）表達水平和Th1/Th2 比值差異；分析EBV-DNA 病毒載量與Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物水平的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料進行正態(tài)性檢驗，確認(rèn)服從正態(tài)分布，表示為（±s），根據(jù)方差齊性檢驗的結(jié)果，應(yīng)用t檢驗或Welcht檢驗；采用Spearson 相關(guān)性分析法分析EBV-DNA 病毒載量與Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物水平的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV 組和健康組Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物、Th1/Th2 比值比較

EBV 組的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、Th1/Th2 均高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 EBV 組和健康組Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物、Th1/Th2 比值比較(±s)

表1 EBV 組和健康組Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物、Th1/Th2 比值比較(±s)

?

2.2 高EBV 組和低EBV 組Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物、Th1/Th2 比值比較

高EBV 組的IFN-γ、IL-2、Th1/Th2 均低于低EBV 組，IL-4、IL-6 水平均高于低EBV 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 高EBV 組和低EBV 組Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物、Th1/Th2 比值比較(±s)

表2 高EBV 組和低EBV 組Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物、Th1/Th2 比值比較(±s)

?

2.3 EBV-DNA 病毒載量與Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性分析

Spearson 分析結(jié)果顯示，EBV-DNA 病毒載量與IFN-γ、IL-2、Th1/Th2 呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），與IL-4、IL-6 呈正相關(guān)性（P＜0.05）。見表3。

表3 EBV-DNA 病毒載量與Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性分析

3 討論

EBV 感染可引發(fā)多種疾病，累及全身多個器官，是一種常見的人類皰疹病毒，并與免疫系統(tǒng)相關(guān)性疾病密切相關(guān)。大部分兒童在早期生命階段感染EBV，在1～2 歲時出現(xiàn)EBV 抗體血清轉(zhuǎn)換，此時大部分感染案例并不復(fù)雜，甚至容易被忽視。對于絕大多數(shù)感染者而言，潛伏感染似乎不會影響總體健康；然而，潛伏期的失調(diào)或無法控制的裂解性感染可能導(dǎo)致淋巴組織增殖性疾病和免疫系統(tǒng)相關(guān)性疾病的進展[6]。

本研究結(jié)果顯示，EBV 組的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、Th1/Th2 均高于健康組（P＜0.05）。這表示EBV感染患兒的Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物水平顯著升高。既往Yang D 等[7]的研究中，其傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒的IFN-γ、IL-6 等水平均高于對照組（P＜0.05），本研究與既往研究結(jié)果一致。這可能是因為EBV 進入B 淋巴細(xì)胞后不斷復(fù)制，激活T 淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞大量活化擴增。有研究顯示，EB 病毒感染的主要細(xì)胞類型是上皮細(xì)胞和B 細(xì)胞[8]。這可能是因為在EBV 病毒的結(jié)構(gòu)中，除宿主細(xì)胞衍生的膜蛋白外，還包埋若干病毒蛋白，病毒包膜蛋白是糖蛋白（glycoprotein, GP），EBV 病毒的趨向性由包膜GP 決定，而GP 又因宿主細(xì)胞的不同而存在差異[9]。EBV 感染的主要細(xì)胞類型是上皮細(xì)胞和B 細(xì)胞。因為EBV 的傳播方式是通過唾液傳播給受體，上皮細(xì)胞是第一個被感染的細(xì)胞類型。當(dāng)EBV 從口咽上皮釋放后進入下層組織時，B 細(xì)胞被感染[10]。由于包膜GP 的組成，上皮細(xì)胞釋放的EBV 病毒粒子優(yōu)先于B 細(xì)胞，而B 細(xì)胞釋放的EBV病毒粒子優(yōu)先于上皮細(xì)胞[11]。

本研究結(jié)果顯示，高EBV 組的IFN-γ、IL-2、Th1/Th2 均低于低EBV 組，IL-4、IL-6 水平均高于低EBV 組（P＜0.05）；Spearson 分析結(jié)果顯示，EBVDNA 病毒載量與IFN-γ、IL-2、Th1/Th2 呈負(fù)相關(guān)性，與IL-4、IL-6 呈正相關(guān)性（P＜0.05）。這提示伴隨EBV 病毒載量的升高，Th1/Th2 失衡加重。沈燕等[12]研究中顯示，EBV-DNA 病毒載量與IFN-γ 呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.519，P＜0.001），與IL-4 呈正相關(guān)性（r=0.607，P＜0.001），本研究與既往研究結(jié)果相似。EB 病毒感染后，機體免疫系統(tǒng)會被激活以應(yīng)對病毒。這涉及T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答，其中包括Th1 和Th2 細(xì)胞的調(diào)節(jié)。Th1 細(xì)胞主要產(chǎn)生IFN-γ、IL-2 等細(xì)胞因子對抗病毒感染。Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答有助于清除被EB 病毒感染的細(xì)胞，并抑制病毒的復(fù)制[13]。Th2 細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-6 和IL-13 等細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答。在EB 病毒感染中，Th2 細(xì)胞可能對炎癥反應(yīng)起到一定的調(diào)節(jié)作用[14]。而根據(jù)研究顯示，EBV病毒載量的高低與Th1 和Th2 細(xì)胞的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[15]。高EBV-DNA 病毒載量的患兒往往伴隨著免疫系統(tǒng)的強烈反應(yīng)。在高EBV-DNA 病毒載量情況下，機體的免疫系統(tǒng)往往會出現(xiàn)Th1/Th2 失衡，即Th2 細(xì)胞活化和分泌增加，而Th1 細(xì)胞活化和分泌減少。這可能是由于EBV 感染抑制了Th1細(xì)胞的功能，同時促進了Th2 細(xì)胞的發(fā)育和功能[16]。而不平衡的Th1/Th2 比例可能會影響EBV感染結(jié)果[17]。例如，如果Th1 免疫應(yīng)答過弱而相對Th2 免疫應(yīng)答過強，則可能導(dǎo)致病毒的持續(xù)感染和病情的惡化。同時，低EBV-DNA 病毒載量的患兒則表現(xiàn)出較低程度的病毒復(fù)制活動和免疫系統(tǒng)反應(yīng)。

綜上所述，EBV 感染患兒Th1/Th2 型細(xì)胞標(biāo)志物水平呈現(xiàn)出明顯變化，并且隨著EBV 病毒載量的升高，IFN-γ、IL-2 水平升高，而IL-4、IL-6 水平降低，Th1/Th2 失衡加重。這能夠為深入探究EBV 感染的免疫學(xué)機制、評估感染嚴(yán)重程度從而制定適宜的臨床策略提供參考。