邵小芙,果 波,高 嵩,曹 陽(yáng)

(江蘇海洋大學(xué) a.藥學(xué)院; b.江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222005)

近年來(lái),隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與研究手段的豐富,陸地生物得以被廣泛且更為深入地研究[1]。較之于陸地,海洋資源占據(jù)著全球面積的70%,且存在較為極端的生存環(huán)境,生物隨之進(jìn)化出可適應(yīng)不同環(huán)境的生存能力[2-3]。隨著對(duì)海洋研究的深入,一些結(jié)構(gòu)新穎且具有獨(dú)特生物活性的活性物質(zhì)逐漸為人們所關(guān)注[4-5]。在對(duì)維系海洋生物生命活動(dòng)的酶作用的探索中,由于生存環(huán)境的選擇及限制,一些被挖掘的酶呈現(xiàn)出特殊的活性作用,如較高的滲透壓承受能力及高鹽溶液下的穩(wěn)定性[6]。

海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶區(qū)別于以往發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)轉(zhuǎn)氨酶,在其催化位點(diǎn)的遠(yuǎn)端手性中心同樣具有立體識(shí)別能力[7],這種能力在轉(zhuǎn)氨酶的報(bào)道案例中是極為罕見(jiàn)的[8],即使是少數(shù)存在第二位點(diǎn)選擇能力的轉(zhuǎn)氨酶,也更多是在靠近催化位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別[9-10]。海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶的遠(yuǎn)端(S)-型手性中心選擇催化能力被Gavin等進(jìn)行多底物深入研究,測(cè)試結(jié)果表明這種具有特殊催化活性的轉(zhuǎn)氨酶可在以1-四氫萘胺和1-氨基茚滿為胺基供體的轉(zhuǎn)胺反應(yīng)中發(fā)揮高效活性,并且可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)端手性中心的識(shí)別與催化,生成的酮類產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值可高達(dá)93%[7]。海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶的遠(yuǎn)端(S)-型手性中心選擇能力同樣可以識(shí)別拆分抗抑郁藥物舍曲林關(guān)鍵中間體[11]。經(jīng)海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶中間體拆分可簡(jiǎn)化舍曲林的合成工藝[12]。

但酶材料的制備工藝較為復(fù)雜,使用時(shí)易造成較差的穩(wěn)定性,且無(wú)法實(shí)現(xiàn)持續(xù)性使用,導(dǎo)致大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用成本較高。固定化工藝是上述問(wèn)題的有效解決途徑。經(jīng)固定化的酶相較于游離酶具備更強(qiáng)的穩(wěn)定性及環(huán)境抗壓能力,且固定化后的酶可克服游離酶無(wú)法回收利用的缺點(diǎn),降低生產(chǎn)成本[13]。現(xiàn)有的吸附法[14]、交聯(lián)法[15]、包埋法[16]、載體共價(jià)結(jié)合法[17]等主要固定化工藝由于非精細(xì)化固定方式的限制,往往會(huì)造成一定的酶活性損失。

噬菌體展示技術(shù)自20世紀(jì)90年代被開(kāi)發(fā)應(yīng)用以來(lái)[18],已成功應(yīng)用于多種病毒疫苗作為展示載體[19]。T4噬菌體是一種T-偶數(shù)型裂解性細(xì)菌侵染病毒噬菌體,由頭部、尾部及尾絲三部分構(gòu)成[20]。T4噬菌體頭部由主要衣殼蛋白gp23及次要衣殼蛋白gp24組成衣殼骨架。Hoc(高抗原性外衣殼蛋白)及Soc(小外衣殼蛋白)為二十面體形狀的衣殼上附加結(jié)合蛋白。由于Hoc及Soc蛋白與T4噬菌體衣殼之間以可分離及高生物親和的方式結(jié)合,外源肽段及蛋白序列被允許與其融合從而展示在T4噬菌體衣殼的結(jié)合位點(diǎn)[19]。本研究建立以T4噬菌體衣殼為固定化系統(tǒng),采取親和固定化工藝構(gòu)建海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶的精細(xì)化生物材料固定化體系,以期實(shí)現(xiàn)酶活的高效保留回收。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶質(zhì)粒及融合蛋白擴(kuò)增引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成,Taq PCR擴(kuò)增酶、高保真酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自莫納生物科技有限公司,NdeⅠ內(nèi)切酶試劑盒、Hind Ⅲ內(nèi)切酶試劑盒購(gòu)自江蘇愚公生物科技有限公司,大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)-RIPL感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司,細(xì)菌蛋白抽提試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司,(S)-ɑ-甲基芐胺、5′-磷酸吡哆醛、丙酮酸鈉、乙腈購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

AKTA蛋白純化系統(tǒng),英國(guó)GE Healthcare公司;Centrifuge 5424R高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf股份公司;低溫超高壓連續(xù)流破碎機(jī),廣州聚能納米生物科技股份有限公司;島津LC-20型高效液相色譜儀,日本島津公司;PCR熱循環(huán)儀器,伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;迷你金屬浴,杭州米歐儀器有限公司;藍(lán)光速射儀,北京諾禾致源科技股份有限公司;生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;微量分光光度計(jì),賽默飛世爾科技公司。

1.3 Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶N端的融合蛋白設(shè)計(jì)

將包含海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)pET28a表達(dá)載體轉(zhuǎn)入至DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中復(fù)制,使用無(wú)縫克隆技術(shù)構(gòu)建Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶N端的融合蛋白表達(dá)序列。以位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶序列N端的NdeⅠ內(nèi)切酶識(shí)別序列作為切割位點(diǎn)進(jìn)行載體切割,形成線性化載體;無(wú)縫克隆重組技術(shù)中Soc片段插入載體所需的載體同源臂通過(guò)PCR擴(kuò)增引物引入,正向引物及反向引物的兩端各含一段載體及Soc片段序列。反向引物的載體序列及Soc片段序列之間引入9堿基大小的柔性linker,避免海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶及Soc蛋白折疊表達(dá)的相互影響,Soc片段擴(kuò)增正反引物序列見(jiàn)表1。

表1 Soc片段擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequence of Soc fragment amplification

1.4 Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶C端的融合蛋白設(shè)計(jì)

Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶C端的融合蛋白表達(dá)序列同樣以無(wú)縫克隆技術(shù)構(gòu)建,選擇實(shí)驗(yàn)室原有的含有Soc片段的pET28b大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為構(gòu)建載體。線性化載體的獲得基于Soc片段序列N端存在HindⅢ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn);海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶序列插入所需的載體同源臂同使用擴(kuò)增引物引入,反向引物的載體序列及海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶片段序列之間同引入9堿基大小柔性linker,避免海洋脫氮假弧菌ω轉(zhuǎn)氨酶及Soc蛋白折疊表達(dá)的相互影響。海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶擴(kuò)增正反引物序列見(jiàn)表2。

表2 海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶片段擴(kuò)增引物序列Table 2 Primer sequence of marine P. denitrificans ω-transaminase fragment amplification

1.5 Soc與海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶重組融合蛋白表達(dá)

兩種重組融合蛋白首先轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序。選取測(cè)序結(jié)果正確的重組融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌RIPL感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行重組體的少量培養(yǎng)表達(dá),對(duì)重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)溫度進(jìn)行了篩選,選取的溫度分別為16 ℃和23 ℃。使用細(xì)菌蛋白抽提試劑盒對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞進(jìn)行處理,結(jié)果通過(guò)10%SDS-PAGE進(jìn)行可視化觀察。

1.6 重組融合蛋白的T4噬菌體衣殼固定化

選取表達(dá)情況適宜的重組融合蛋白,進(jìn)行固定化展示。重組酶固定化的反應(yīng)體積為4 mL,加入酶3.86×10-2μmol,加入T4噬菌體衣殼1.172×10-6μmol,在固定化緩沖液(PI-Mg buffer)環(huán)境下孵育1 h,孵育溫度為16 ℃。孵育后的反應(yīng)液經(jīng)離心收集固定化后的酶,離心轉(zhuǎn)速為15 000 r/min,時(shí)間為70 min。用1 mL重組酶儲(chǔ)存緩沖液重懸收集到的離心沉淀,清洗未固定化的游離酶,再以15 000 r/min離心70 min收集固定化酶,離心沉淀用100 μL儲(chǔ)存緩沖液重懸。

1.7 固定化酶活性評(píng)價(jià)

固定后的酶活保留是酶固定化效果的一大指征。以(S)-α-甲基芐胺作為氨基供體底物,丙酮酸鈉作為氨基受體,測(cè)定轉(zhuǎn)氨酶經(jīng)固定化后的催化活性保留效果。測(cè)定條件為反應(yīng)溫度30 ℃,時(shí)間1 h。以乙酸乙酯進(jìn)行產(chǎn)物苯乙酮及殘留氨基供體底物的有機(jī)相提取,收集的有機(jī)相通過(guò)TLC進(jìn)行結(jié)果觀察。TLC的展開(kāi)條件為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=9∶1。

固定化酶的酶活回收效率是固定化效果另一大指征。回收采用的測(cè)試底物及條件同酶活測(cè)試。加入酶溶液?jiǎn)?dòng)催化反應(yīng),待達(dá)到反應(yīng)時(shí)間,將固定化酶反應(yīng)體系放置于4 ℃離心機(jī)中,在15 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心70 min實(shí)現(xiàn)固定化酶回收;小心轉(zhuǎn)移離心后的上清反應(yīng)液于干凈的1.5 mL EP管中,向離心沉淀中加入1 mL lysis buffer清洗殘留的溶液,小心吸走清洗液,加入100 μL lysis buffer對(duì)固定化酶進(jìn)行重懸,加入至反應(yīng)液中開(kāi)啟下一輪循環(huán)催化反應(yīng)。循環(huán)催化反應(yīng)共計(jì)4組,設(shè)置3組平行。經(jīng)催化的反應(yīng)液同樣以等體積的乙酸乙酯進(jìn)行有機(jī)相萃取。萃取的乙酸乙酯通過(guò)高效液相進(jìn)行檢測(cè),高效液相檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2 結(jié)果

2.1 Soc與海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶重組融合蛋白選擇

兩種不同誘導(dǎo)表達(dá)溫度下的融合蛋白呈現(xiàn)出不同的上清融合表達(dá)效果。Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶N端的重組融合蛋白于膠圖誘導(dǎo)上清通道中可見(jiàn)清晰明顯條帶;Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶C端的重組融合蛋白的誘導(dǎo)上清通道中目的條帶幾乎不可見(jiàn),對(duì)比圖如圖1所示。膠圖結(jié)果表明,Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶N端的重組融合蛋白上清可溶表達(dá)性質(zhì)更佳,因此選擇Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶N端的重組融合蛋白作為固定化反應(yīng)使用的融合蛋白。

a Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶N端重組融合蛋白

b Soc位于海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶C端重組融合蛋白注:紅色箭頭所指為重組融合目的蛋白。圖1 兩種重組融合蛋白上清融合表達(dá)可溶性驗(yàn)證Fig.1 Supernatants soluble expression verification of two recombinant fusion protein

2.2 Soc與海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶重組融合蛋白表達(dá)優(yōu)化

將選擇的重組蛋白進(jìn)行大批量發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn),上清可溶表達(dá)的重組蛋白收率較低,無(wú)法滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求,因此需對(duì)重組蛋白的上清可溶表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。本文選擇具有較高mRNA穩(wěn)定性的BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞作為重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步表達(dá)。重組蛋白純化結(jié)果對(duì)比膠圖如圖2所示。從圖中可以看出,經(jīng)BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白上清可溶表達(dá)量得到顯著提升,可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)于重組蛋白產(chǎn)量的要求。

a 大腸桿菌RIPL感受態(tài)表達(dá)系統(tǒng)

b 大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)表達(dá)系統(tǒng)注:紅色箭頭指示為目的蛋白。圖2 重組融合蛋白上清可溶表達(dá)優(yōu)化前后純化膠圖Fig.2 Purified gel diagram of recombinant fusion protein before and after supernatant soluble expression optimization

2.3 重組融合蛋白位于T4噬菌體衣殼的固定化展示

固定化結(jié)果采取SDS-PAGE膠圖進(jìn)行可視化驗(yàn)證,T4噬菌體衣殼中組成數(shù)量為930拷貝的主要衣殼蛋白gp23(大小為49 kDa)可作為T4噬菌體存在的判定依據(jù)。如圖3所示,經(jīng)固定展示的體系電泳泳道中位于49 kDa附近處存在蛋白條帶,證明了gp23蛋白的存在,且T4噬菌體衣殼其他位點(diǎn)處存在的蛋白皆可在固定展示體系電泳泳道中找到與之相對(duì)應(yīng)的條帶,驗(yàn)證了固定展示體系中T4噬菌體衣殼的存在。固定展示體系電泳泳道中位于重組融合蛋白大小(62 kDa)位置處的清晰條帶證明了固定展示體系中重組融合蛋白的存在。以上結(jié)果說(shuō)明,經(jīng)重組構(gòu)建表達(dá)的融合蛋白被成功固定于T4噬菌體衣殼的Soc結(jié)合位點(diǎn)處。

注:紅色箭頭指示為重組融合蛋白;藍(lán)色箭頭指示為T4噬菌體衣殼主要衣殼蛋白gp23。圖3 重組融合蛋白與T4噬菌體衣殼固定化展示驗(yàn)證膠圖Fig.3 Verified gel map of recombinant fusion protein immobilization with T4 phage capsid

2.4 固定化酶的活性驗(yàn)證

固定化酶催化性能檢測(cè)的TLC結(jié)果如圖4所示。游離酶及固定酶的反應(yīng)體系加入的酶催化溶液的濃度相同,游離酶及固定酶的反應(yīng)體系中位于產(chǎn)物苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品顯影位置處均具有一致的顯影產(chǎn)生,兩者Rf值相同,且在底物(S)-α-甲基芐胺的檢測(cè)通道內(nèi)并無(wú)苯乙酮位置處的顯影產(chǎn)生。TLC結(jié)果證明了游離酶及固定酶反應(yīng)體系中有產(chǎn)物苯乙酮的生成,且游離酶及固定酶的反應(yīng)體系中均無(wú)與(S)-α-甲基芐胺相同Rf值的物質(zhì)顯示,從而驗(yàn)證了經(jīng)T4噬菌體衣殼固定化后的酶仍保留了較好的生物催化活性。

圖4 固定化酶酶活TLC測(cè)試Fig.4 Immobilized enzyme TLC activity test

2.5 固定化酶回收性能驗(yàn)證

為確定經(jīng)固定化酶的回收能力,對(duì)經(jīng)離心回收的固定化酶催化反應(yīng)體系上清進(jìn)行了15%SDS-PAGE驗(yàn)證,以相同濃度的重組融合酶催化反應(yīng)體系為對(duì)照,15%SDS-PAGE的測(cè)試量相同。測(cè)試結(jié)果如圖5所示,重組融合酶的催化反應(yīng)體系電泳泳道中可見(jiàn)60 kDa處明顯蛋白條帶,固定化酶催化反應(yīng)體系中相應(yīng)處的蛋白條帶幾不可見(jiàn)。由此可證,經(jīng)T4噬菌體衣殼固定化后的重組融合酶經(jīng)高速離心得到了較好回收。

注:紅色箭頭指示催化體系電泳泳道中的重組融合蛋白條帶;藍(lán)色箭頭指示重組酶對(duì)照電泳泳道中的重組融合蛋白條帶。圖5 固定化酶回收測(cè)試Fig.5 Immobilized enzyme recovery test

固定化酶的酶活回收效率經(jīng)HPLC測(cè)試后,繪制成線性圖,回收結(jié)果如圖6所示。經(jīng)4輪催化測(cè)試,平均每輪酶活的回收效率>92%,由此可以看出,經(jīng)T4噬菌體衣殼固定化的海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶可實(shí)現(xiàn)良好的酶催化活性回收。

a 酶活回收測(cè)試體系的HPLC監(jiān)測(cè)

b 酶活回收率曲線圖6 固定化酶酶活回收效率測(cè)試Fig.6 Enzyme activity recovery efficiency test of immobilized enzyme

3 討論

由于海洋資源占據(jù)著全球資源的70%,且存在廣泛的生物多樣性,海洋活性物質(zhì)的挖掘及開(kāi)發(fā)占據(jù)了新型活性物質(zhì)挖掘的重要一環(huán)。海洋環(huán)境與陸地具有較大差異,使得海洋生物的生命活動(dòng)維持所需活性物質(zhì)會(huì)區(qū)別于陸地生物。隨著人們對(duì)海洋生物探索的不斷深入,一些結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的活性物質(zhì)逐漸被發(fā)現(xiàn)。

來(lái)自于海洋脫氮假弧菌的ω-轉(zhuǎn)氨酶具有區(qū)別于以往發(fā)掘ω-轉(zhuǎn)氨酶的獨(dú)特遠(yuǎn)端手性中心(S)-型選擇性,這在酶催化領(lǐng)域也是較為少見(jiàn)的。由于具有獨(dú)特的選擇性,海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶可在1-四氫萘胺和1-氨基茚滿的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中發(fā)揮特別的作用,生產(chǎn)的酮類也具有很高的對(duì)映體過(guò)量值,且這種獨(dú)特胺手性中心選擇性可應(yīng)用于抗抑郁藥物關(guān)鍵中間體的拆分制備。當(dāng)前的酶催化材料存在著穩(wěn)定性不高、無(wú)法重復(fù)性利用的缺點(diǎn),這在一定程度上限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用,而引入固定化工藝則存在解決上述問(wèn)題的可能性,但這面臨著另外一個(gè)問(wèn)題,即以往常用材料的固定化工藝通常存在吸附能力不強(qiáng)而易解析脫落、載體活化復(fù)雜、易造成酶的精細(xì)功能喪失等缺點(diǎn)。

本研究使用的T4噬菌體衣殼為生物固定化材料,與T4噬菌體衣殼附加Soc蛋白融合后的海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶,可基于T4噬菌體衣殼與Soc蛋白之間的高生物親和力自組裝固定于T4噬菌體衣殼的Soc結(jié)合位點(diǎn),在構(gòu)象上給予酶催化活動(dòng)更多的空間,這種精細(xì)化的固定化方式可實(shí)現(xiàn)酶催化活性的高效保留。通過(guò)兩種不同結(jié)構(gòu)重組融合蛋白的設(shè)計(jì)及選擇優(yōu)化,本研究成功實(shí)現(xiàn)可與T4噬菌體衣殼結(jié)合重組融合蛋白的表達(dá),且獲得可滿足實(shí)驗(yàn)需求的較高上清可溶表達(dá)量的重組融合蛋白。通過(guò)TLC測(cè)定了固定化酶的催化活性,TLC的Rf值結(jié)果證明了固定化酶活性的保留。同時(shí)對(duì)固定化酶的催化體系進(jìn)行了簡(jiǎn)單離心回收,催化活性回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,平均每輪的酶活回收率>92%。以上結(jié)果揭示,經(jīng)T4噬菌體衣殼固定化后,海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶的催化性能得以被有效保留,且能夠?qū)崿F(xiàn)高效回收,可進(jìn)一步推動(dòng)海洋脫氮假弧菌ω-轉(zhuǎn)氨酶催化工藝中的應(yīng)用。