王 穎,趙龍成,王浩同,杜建周,王洪斌,趙曉恒,程漢良,許建和,陳香凝,丁祝進(jìn)

(1.江蘇海洋大學(xué) a.海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院; b.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; c.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; d.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 連云港 222005; 2.鹽城工學(xué)院 材料科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 鹽城 224051)

0 引言

條斑紫菜[1](Porphyrayezoensis),隸屬紅藻綱、紅毛菜科。藻體鮮紫紅色或略帶藍(lán)綠色,卵形或長(zhǎng)卵形,一般高12～70 cm。作為我國重要的經(jīng)濟(jì)海藻之一,年總產(chǎn)值超50億元,廣泛栽培于江蘇、山東沿海地區(qū)[2]。條斑紫菜是一種常見的海藻,也被稱為紫菜、海苔或海帶。它是一種富含營養(yǎng)的食物,特別是富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì),被廣泛用于制作壽司、海苔包飯等傳統(tǒng)食品,也可作為調(diào)味料或零食食用。近年來,隨著對(duì)條斑紫菜的需求增加和認(rèn)識(shí)的提高,其養(yǎng)殖規(guī)模也在不斷擴(kuò)大,但也帶來一些問題,如過高密度的栽培和水質(zhì)惡化等。這些問題會(huì)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境和紫菜的健康生長(zhǎng)產(chǎn)生一定影響[3]。

條斑紫菜綠斑病是嚴(yán)重危害紫菜生長(zhǎng)的病害,在整個(gè)紫菜栽培期間都有可能發(fā)生,尤以每年的11—12月份最為嚴(yán)重,特別是降雨或采收后極易發(fā)生[4]。綠斑病主要出現(xiàn)在幼葉或成葉階段,并且多數(shù)發(fā)生在營養(yǎng)豐富的海灣或有機(jī)物廢水較多的外海性海區(qū)[5]。綠斑病通過水體傳播,感染紫菜葉片,導(dǎo)致葉片出現(xiàn)綠色斑點(diǎn)或綠色條紋。嚴(yán)重的病情會(huì)導(dǎo)致葉片變形、腐爛甚至死亡。已有報(bào)道表明,上述病害在韓國和日本的暴發(fā)給條斑紫菜養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。本文實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)條斑紫菜綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌進(jìn)行研究。利用16S rRNA測(cè)序[8]鑒定條斑紫菜綠斑病致病菌,使用固體培養(yǎng)基分析該致病菌的生長(zhǎng)曲線,并利用K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[9]。本實(shí)驗(yàn)可為條斑紫菜綠斑病病原防治提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紫菜綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌的PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定

條斑紫菜綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌由江蘇海洋大學(xué)海洋藻類生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存。首先,分別制備海水固體/液體培養(yǎng)基以及LB固體/液體培養(yǎng)基(見表1),然后對(duì)分離的條斑紫菜綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌菌株進(jìn)行劃線培養(yǎng),培養(yǎng)24 h挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。

表1 培養(yǎng)基配方Table 1 Medium formula

獲取16S rRNA基因序列進(jìn)行鑒定[10]。一般來說,若所測(cè)菌株的16S rRNA基因序列與已知典型菌株基因序列的相似度小于97%,則認(rèn)為該菌株可能是新種;若兩者相似度大于97%,則仍不能確定是這個(gè)已知種,只能認(rèn)為最接近于該種。如果需要更準(zhǔn)確的結(jié)果,還需要進(jìn)行DNA-DNA雜交等。

采用TIANGEN公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取細(xì)菌總DNA,所有操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。提取的總DNA通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)濃度與純度。以提取的總DNA為模板,進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)的PCR擴(kuò)增,并利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析條帶大小,將PCR產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2 深海微小桿菌生長(zhǎng)曲線制作

1.2.1 制備深海微小桿菌菌種 先制作深海微小桿菌固體培養(yǎng)基,然后在培養(yǎng)基平板上面用接種環(huán)進(jìn)行平板劃線。培養(yǎng)18 h后,在超凈工作臺(tái)里面挑取單菌落接入到海水液體培養(yǎng)基以及LB液體培養(yǎng)基中。每種液體培養(yǎng)基各5 mL,于37 ℃ 170 r/min培養(yǎng)15 h后測(cè)量其OD600,并用于下一步接種。

1.2.2 分組及標(biāo)記編號(hào) 取滅完菌之后的2 mL離心管共108支,分為4組每組27支,每3 h為一個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn),共測(cè)9個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(0,3,6,9,12,15,18,21,24 h),每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)測(cè)3個(gè)重復(fù)的OD值,并計(jì)算平均值。海水培養(yǎng)基28 ℃組標(biāo)記為dH,海水培養(yǎng)基37 ℃組標(biāo)記為H;LB培養(yǎng)基28 ℃組標(biāo)記為dL,LB培養(yǎng)基37 ℃組標(biāo)記為L(zhǎng)。

1.2.3 接種培養(yǎng) 根據(jù)分組,分別在每個(gè)2 mL離心管中加入1 mL海水液體培養(yǎng)基或LB液體培養(yǎng)基,隨后在每支離心管中分別加入10 μL深海微小桿菌菌種,按照分組分別在28 ℃或37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)。然后,分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)將離心管取出,于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 生長(zhǎng)曲線制作 分別測(cè)定各組9個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的深海微小桿菌OD600吸光值,并據(jù)此計(jì)算和制作生長(zhǎng)曲線。

1.3 深海微小桿菌藥敏試驗(yàn)方法

使用K-B紙片擴(kuò)散法[11]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。先用平板畫線法對(duì)深海微小桿菌進(jìn)行培養(yǎng),之后挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。隨后,將菌種稀釋40倍后在每個(gè)平板上均勻涂布200 μL,涂布完成后干燥3～5 min。然后,將20種抗生素(青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、新霉素、四環(huán)素、氯霉素、麥迪霉素、多粘菌素B、林可霉素、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、諾氟沙星、氧氟沙星、羅紅霉素紙片、恩諾沙星、磷霉素)藥敏紙片放到固體培養(yǎng)基中央,每個(gè)藥敏紙片做3個(gè)重復(fù),標(biāo)記并用封口膜封好后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)6,18,和24 h后使用游標(biāo)卡尺[12]測(cè)量抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)來表示,并用軟件SPSS 17.0的單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行顯著性分析。其中,統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性水平設(shè)置為P<0.05,極顯著水平設(shè)置為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌鑒定結(jié)果分析

圖1是綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌16S rRNA基因序列擴(kuò)增結(jié)果,PCR條帶單一,送上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)官網(wǎng)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,結(jié)果表明該紫菜綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌與深海微小桿菌同源性達(dá)97.94%。

注:1～8表示16S rRNA基因在退火溫度為50～64 ℃梯度下的擴(kuò)增結(jié)果,M為DNA marker。圖1 紫菜綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of 16S rRNA amplification of the dominant pathogen of Porphyra green spot disease

2.2 深海微小桿菌生長(zhǎng)曲線分析

如圖2所示,深海微小桿菌在海水培養(yǎng)基中不同溫度下的生長(zhǎng)曲線整體呈上升趨勢(shì)。在28 ℃條件下,深海微小桿菌在0～6 h內(nèi)生長(zhǎng)較為緩慢,OD600吸光值在9 h和15 h出現(xiàn)2次波動(dòng),在24 h達(dá)到峰值。與28 ℃相比,深海微小桿菌在37 ℃條件下生長(zhǎng)曲線更加平緩,并在21 h達(dá)到峰值。

圖2 深海微小桿菌在海水培養(yǎng)基中不同溫度下的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Microbacter bathyae at different temperatures in seawater medium

如表2所示,在海水培養(yǎng)基中,條件為37 ℃時(shí)OD600吸光值明顯高于 28 ℃時(shí)的OD600吸光值。而在LB培養(yǎng)基中,在3,6,12 h時(shí),37 ℃的OD600吸光值高于 28 ℃;在9,15,18,21,24 h時(shí),28 ℃吸光值明顯高于37 ℃,并且在24 h時(shí),條件為28 ℃的OD600吸光值達(dá)到最大。

表2 深海微小桿菌在不同培養(yǎng)基各時(shí)間節(jié)點(diǎn)OD600吸光值Table 2 OD600 value of Microbacter bathyae at different time points of various medium

如圖3所示,深海微小桿菌在LB培養(yǎng)基中28 ℃條件下生長(zhǎng)曲線同樣出現(xiàn)波動(dòng)。主要表現(xiàn)為6～9 h之間生長(zhǎng)速度顯著加快,隨后持續(xù)生長(zhǎng),并在24 h達(dá)到峰值。在37 ℃條件下,深海微小桿菌在12 h的OD600吸光值最高,隨后下調(diào)?？傮w而言,深海微小桿菌在兩種培養(yǎng)基中37 ℃條件下生長(zhǎng)情況均比在28 ℃條件下更加穩(wěn)定,且在海水培養(yǎng)基中深海微小桿菌的菌種豐度普遍要高于LB培養(yǎng)基。

圖3 深海微小桿菌在LB培養(yǎng)基中不同溫度下的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of Microbacter bathyae on LB medium at different temperatures

2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)初步探索了深海微小桿菌對(duì)常見抗生素的敏感性。表3為各種抗生素紙片在6,18,24 h抑制深海微小桿菌生長(zhǎng)所形成的抑菌圈直徑。結(jié)果表明,同一種抗生素在3個(gè)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)形成的抑菌圈大小無顯著差異,且深海微小桿菌對(duì)20種抗生素均表現(xiàn)出較高的敏感性,其中青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、麥迪霉素和四環(huán)素的抑菌效果更加顯著。

表3 各種抗生素不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)抑菌圈直徑Table 3 Diameter of bacteriostatic zone at different time points of various antibiotics mm

根據(jù)藥敏性判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑20 mm以上為極敏,15～20 mm為高敏,10～14 mm為中敏,10 mm以下為低敏,0 mm為不敏,所以可以判斷出各種抗生素的藥敏性。從表4可以看出,每種抗生素產(chǎn)生的抑菌圈的透光度也有區(qū)別。例如氯霉素(圖4a)產(chǎn)生的抑菌圈較小,并且圈內(nèi)較為模糊。麥迪霉素(圖4b)比氯霉素(圖4a)圈內(nèi)更為模糊,并且其邊界更加不清晰。四環(huán)素(圖4c)抑菌圈雖然小但是透亮。而青霉素(圖4d)抑菌圈大并且透亮。表4中有少許抗生素有圈內(nèi)模糊的情況,模糊的原因可能是此種抗生素具有抑菌效果,卻無法做到完全殺滅這種細(xì)菌,因此在圈內(nèi)依然有少許深海微小桿菌在生長(zhǎng)。從表4中還能看出其他異常情況。如青霉素(圖4d),其抑菌圈內(nèi)可較明顯地分為內(nèi)圈和外圈,而且在圈內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)有些許菌落,此種屬于特殊情況。造成的原因可能是實(shí)驗(yàn)誤差問題導(dǎo)致深海微小桿菌在其抑菌圈內(nèi)生長(zhǎng),但并不能表明深海微小桿菌對(duì)青霉素會(huì)產(chǎn)生耐藥性。

b 麥迪霉素

c 四環(huán)素

d 青霉素圖4 深海微小桿菌藥敏試驗(yàn)代表性圖例Fig.4 Representative examples of antibiotic susceptibility test of Microbacter bathyae

3 討論

綠斑病首次發(fā)現(xiàn)于日本,其病原較為廣泛,從患病紫菜中可以分離出微球菌[13]、假單胞菌[14]以及弧菌[15]。中國已報(bào)道檸檬假交替單胞菌(Pseudoalteromonascitrea)引起的條斑紫菜綠斑病[16]。目前報(bào)道的綠斑病病原菌大部分具有較強(qiáng)的胞外酶活性,這些胞外酶導(dǎo)致的宿主損傷可能是引起紫菜葉片綠斑的重要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn),葉綠體病毒也可以引起條斑紫菜綠斑病的發(fā)生[17]。而在本文實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過若干次實(shí)驗(yàn)與條件變換,發(fā)現(xiàn)綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌經(jīng)過16S rRNA基因序列擴(kuò)增結(jié)果與深海微小桿菌同源性達(dá)97.94%。這說明綠斑病的優(yōu)勢(shì)病原菌最接近深海微小桿菌,但是到目前為止對(duì)深海微小桿菌的研究報(bào)道較少。

本文研究采用了光密度(OD)測(cè)量[18]結(jié)果反應(yīng)深海微小桿菌的生長(zhǎng)情況。該方法通過檢測(cè)培養(yǎng)基濃度,以培養(yǎng)基濃度代表其中菌的數(shù)量。培養(yǎng)基的濃度與OD值成正比,OD 值越大表示菌數(shù)量越多。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠快速方便地了解菌的生長(zhǎng)情況,但是由于測(cè)的是OD值,得到的是培養(yǎng)基里面的總菌數(shù),活菌和死菌都包含在內(nèi),就導(dǎo)致了菌的生長(zhǎng)曲線[19]衰亡期測(cè)量不準(zhǔn)確,本研究繪制的生長(zhǎng)曲線衰亡期表現(xiàn)就不太明顯。但是本研究繪制的延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期曲線都可以看出結(jié)果。

由于本種細(xì)菌為深海微小桿菌,其未在美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(clinical and laboratory standard institute,CLSI)里面建立參考數(shù)據(jù),并且CLSI里面的標(biāo)準(zhǔn)以及討論多針對(duì)于臨床,更多的是給人用藥,所以CLSI里面的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于本種細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果參考性不大。但是數(shù)據(jù)結(jié)果仍以表4作為判斷標(biāo)準(zhǔn),抑菌圈透明度數(shù)據(jù)僅為參考數(shù)據(jù)。李純等[20]與曾世祥[21]的研究表明,抑菌圈大小仍然是臨床上判斷細(xì)菌對(duì)藥物敏感性的主要依據(jù)。本藥敏實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)某些抗生素抑菌圈模糊的情況,根據(jù)重復(fù)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷可以排除pH、鹽度等的影響,有可能是某些抗生素對(duì)深海微小桿菌有一定抑制作用,但是無法徹底殺滅該菌。

大量研究表明,紫菜葉狀體的病害[22]是由多方面因素引起的,致病原因十分復(fù)雜。除了本身的生理不適應(yīng)、種質(zhì)退化和環(huán)境條件不適宜等因素外,微生物也是不可忽視的一個(gè)重要因素[23]。綠斑病病癥只是一種表觀特征,多種因素造成的藻體破壞、藻紅素溶出,均可呈現(xiàn)綠斑病癥狀。海水溫度異常升高、降雨或有機(jī)質(zhì)污染引起藻體代謝失常都可能引起紫菜綠斑病[24],但環(huán)境脅迫條件下導(dǎo)致的附生微生物菌群失控是引起紫菜發(fā)生病害的主要原因[25]。通過環(huán)境因子實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)高溫、高密度養(yǎng)殖是引起紫菜綠斑病發(fā)生的主要因子,而海水密度的變化在一定程度上可以減緩病爛速度,這也與海區(qū)栽培情況相印證[26]。每年11、12月份,海區(qū)紫菜進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,此時(shí)網(wǎng)簾上紫菜密度較大,為致病菌提供了豐富的營養(yǎng)和良好的環(huán)境。在正常養(yǎng)殖條件下,條件致病菌數(shù)量一般維持在一定范圍內(nèi),不具備致病力。當(dāng)出現(xiàn)升溫或降雨等環(huán)境變化,條件致病菌的致病性可能增強(qiáng)[27],造成紫菜綠斑病的發(fā)生。合理控制養(yǎng)殖密度,及時(shí)疏苗,密切注意水溫等氣象環(huán)境的變化,充足的干出以改變紫菜表面海水密度等,可以有效抑制綠斑病的發(fā)生。

本文研究通過16S rRNA測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定,建立快速檢測(cè)的LAMP技術(shù)[28],并進(jìn)行生長(zhǎng)特性及藥敏實(shí)驗(yàn)分析,得到深海微小桿菌為綠斑病的優(yōu)勢(shì)病原菌,但其具體感染和致病機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本文以綠斑病優(yōu)勢(shì)致病菌為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行了16S rRNA鑒定,并且繪制了該菌的生長(zhǎng)曲線,研究了其對(duì)藥物的一般敏感性,最終對(duì)該菌的LAMP方法進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)主要結(jié)論如下:

(1) 該菌株為深海微小桿菌(E.profundum),革蘭氏陽性菌。

(2) 該菌株在海水培養(yǎng)基(鹽度為30)中生長(zhǎng)情況比在LB培養(yǎng)基(鹽度為10)中好。

(3) 該菌株在37 ℃時(shí)對(duì)環(huán)境適應(yīng)速度比在28 ℃時(shí)快。

(4) 該菌株對(duì)青霉素、氨芐西林等20種抗生素均有敏感性,即該菌株對(duì)常見的抗生素均無抗藥性。