錢 銘, 程 龍, 熊 媛, 楊 慧1, , 吉 利

(1. 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 藥學部, 江蘇 南京, 210008;2. 南京中醫(yī)藥大學 鼓樓臨床醫(yī)學院, 江蘇 南京, 210008;3. 中國藥科大學 基礎醫(yī)學與臨床藥學學院, 江蘇 南京, 210008;4. 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 老年醫(yī)學科, 江蘇 南京, 210008)

急性心肌梗死(AMI)因冠狀動脈部分或完全阻塞,導致流向心肌的血液阻塞。冠狀動脈閉塞時,心肌缺血、缺氧引起心肌細胞死亡?；颊弑憩F(xiàn)為胸部不適或壓力增大,并可輻射至頸部、下頜、肩部或手臂。據(jù)調查[1]顯示, 2019年全世界有超過200萬的AMI新發(fā)患者,相較于過去10年增加了7倍,急需進一步基礎和臨床研究來應對這種嚴峻挑戰(zhàn)。建立合適的AMI動物模型是推進研究的重要環(huán)節(jié)。目前,常用的AMI模型構建方法包括藥物誘導法和手術結扎法[2], 手術結扎法操作難度較大、存活率較低,且存在操作者手法上的差異。藥物誘導操作簡單,對小鼠損傷較小,存活率高,且實驗人員操作導致的差異較小[3-4]。常用的藥物為異丙腎上腺素(ISO), ISO是β受體激動劑,可激動小鼠心臟β受體,導致心臟血管劇烈收縮,血管灌注不足,大大降低平均動脈壓和舒張壓,引起心臟功能障礙[5]。目前,國內外多采用大鼠皮下注射ISO的方式誘導AMI模型,已有的報道[6-8]中小鼠ISO給藥劑量為10～160 mg, 給藥頻次和取材時間也各不相同,尚無統(tǒng)一的造模方式。由于高劑量ISO給藥的成模率較高[9], 因此本研究選用高劑量150 mg/kg ISO皮下注射的方式,探究不同ISO注射的次數(shù)和時間對心肌損傷的影響,以期明確ISO誘導的AMI模型的最佳造模方式,為臨床AMI的研究提供合適的造模方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

異丙腎上腺素(貨號15627)購自美國Sigma公司,該藥物用于小鼠AMI模型的構建。4%多聚甲醛固定液(BL539A)購自中國Biosharp公司,用于小鼠心臟組織固定。

1.2 模型的構建

實驗動物為無特定病原體(SPF)級8周齡雄性C57BL/6小鼠(購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司),體質量約23 g。動物飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜節(jié)律,自由飲食飲水,恒溫、恒濕。小鼠自購買后,適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為單次注射組及單次空白組, 2次注射組及2次空白組,每組各5只。設計2種不同方案誘導AMI模型,如圖1所示。ISO單次注射組: 小鼠一次皮下注射劑量為150 mg/kg的ISO(生理鹽水配置),分別于注射后2、4、8、16、24取小鼠血樣和心臟組織; 單次空白組給予相同體積的生理鹽水注射。ISO 2次注射組: 小鼠連續(xù)2 d間隔24 h皮下注射150 mg/kg的ISO, 于第2次注射后2、4、8、16、24、48、72 h取小鼠血樣和心臟組織; 2次空白組給予相同體積的生理鹽水注射。本研究涉及到的所有動物實驗均通過了南京鼓樓醫(yī)院動物倫理委員會的批準(倫理號2023AE01032)。

圖1 AMI小鼠模型構建流程圖

1.3 小鼠生化指標檢測

通過摘眼球取血的方式,收集小鼠血樣置于1.5 mL EP管中,血液靜置2 h后,置于4 ℃離心機中4 000轉/min離心5 min, 將上清轉移到另一個1.5 mL EP管中。在生化儀中檢測每個樣本中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、白細胞介素-6(IL-6)、C反應蛋白(CRP)、降鈣素原(CT)的含量。

1.4 小鼠心臟蘇木素-伊紅(H&E)染色

取小鼠心臟后,置于4%多聚甲醛固定液中,石蠟包埋,沿心臟橫切面切取5 μm厚度切片。石蠟切片在二甲苯-無水乙醇-75%酒精中脫臘, H&E染色,無水乙醇-二甲苯脫水,封片后在切片掃描儀中進行圖像采集。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 單次ISO刺激對小鼠心肌損傷的影響

小鼠單次皮下注射ISO, 于注射后不同時間點取小鼠血樣。生化檢測結果顯示,與空白組相比, CK在2 h時濃度最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 而后隨時間延長逐漸降低至正常水平; CK-MB無顯著變化; LDH于2 h應激性升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 降低后于8 h開始再次升高,并在16 h達到最高濃度,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01), 隨后濃度降低,見表1。

表1 單次注射ISO小鼠血清生化指標 U/L

2.2 2次ISO刺激對小鼠心肌損傷的影響

小鼠連續(xù)2次間隔24 h皮下注射ISO 150 mg/kg, 在末次注射后不同時點取小鼠血樣,結果顯示, CK、CK-MB和LDH均在注射后16 h升高至最高濃度,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01), 隨后濃度降低。此外,在2 h時, CK、CK-MB和LDH均有一過性的升高,見表2。

表2 2次注射ISO小鼠血清生化指標 U/L

2.3 AMI模型小鼠生化指標改變

本研究選擇連續(xù)2次皮下注射ISO 150 mg/kg建立小鼠AMI模型,末次注射16 h后取樣進行后續(xù)研究,并設模型組(2次注射ISO 150 mg/kg)和對照組(給予相同體積的生理鹽水注射)。結果顯示,相較于對照組,模型組小鼠的血清中cTnT、AST和ALT均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。但炎癥指標IL-6、PCT和CRP比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 見表3。

表3 2次注射ISO后16 h小鼠血清生化指標

2.4 AMI模型小鼠心臟病理性改變

連續(xù)2次皮下注射ISO 150 mg/kg建立小鼠AMI模型后,本研進一步探究小鼠心肌組織病理結構變化,H&E染色結果顯示,對照組小鼠室間隔心肌細胞排列整齊、致密; 模型組小鼠心肌組織發(fā)生病理學改變,室間隔細胞排列紊亂、疏松,心肌細胞腫脹,細胞膜溶解(圖2)。相較于對照組,模型組室間隔厚度增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01), 見表4。

表4 2次注射ISO后16 h小鼠心室壁厚度改變 μm

A: 對照組; B: 模型組。

3 討 論

心血管疾病是發(fā)達國家和發(fā)展中國家的主要死亡原因,每年約占全世界死亡總數(shù)的20%[10]。由于發(fā)展中國家,特別是城市地區(qū)生活方式改變,AMI發(fā)病率不斷上升,在心血管疾病死亡中的占比越來越大[10-11]。因此,有必要建立合適、便捷、可重復的AMI動物模型,不僅可以有助于研究心血管疾病的發(fā)病機制和病理生理學,也可以為新藥的研發(fā)提供評價藥效的重要工具。AMI是由于冠狀動脈供血與心肌需求不平衡而導致的心肌壞死的急性狀態(tài),圍繞此原理,目前國內外制備AMI動物模型的方法包括藥物誘導法、手術結扎法、低溫冷凍法、冠狀動脈微栓塞法等。其中較常用的方法是手術結扎法和藥物誘導法[2, 12]。手術結扎法主要應用于大鼠及更大體積的實驗動物,通過結扎實驗動物冠狀動脈左前降支造成心室AMI[13]。據(jù)報道[14], 在手術過程中,由于麻醉劑、氣管插管、開胸、肺損傷、傷口感染、心力衰竭等多種因素造成的動物死亡率高達40%。此外,這種方法所造成的梗死面積的大小變異性也較大,結扎位置的輕微變化即可導致梗死面積較大的差異,結扎位置偏上和進針過深則易造成較大的梗死面積和實驗動物的死亡,結扎位置偏下或進針過淺則易導致模型不成功[15-16], 不穩(wěn)定性對實驗進展和結果可造成嚴重影響。冷凍法是通過超低溫造成與冠狀動脈結扎法相似的AMI效果,但其造成的損傷集中在心外膜,與正常臨床上AMI集中在心內膜有所不同[16-17], 不能很好的模擬臨床上AMI患者的病理狀態(tài)。冠狀動脈微栓塞法一般用于大型動物,該技術使用定制的導管選擇性地插入左冠狀動脈,通過導管注入微球引起栓塞。這個過程同時產生多個微梗死,類似于經皮冠狀動脈介入治療后的臨床栓塞,雖然該技術不需要胸外科手術,但實驗操作難度較大,對研究人員技術要求較高[18]。

藥物誘導法操作便捷,可以避免氣管插管、冠狀動脈結扎等手術操作對實驗動物造成的創(chuàng)傷和感染,實驗周期短,因此有較高的實用性、可靠性和較低的實驗動物死亡率,造模成功率高[19]。藥物誘導法使用ISO、阿霉素、血管加壓素等藥物[20]。阿霉素是臨床上的一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥,具有心臟毒性,因此用作心肌損傷模型的制備,但有研究報道阿霉素腹腔注射胃腸道毒性大,易導致注射部位皮膚壞死,模型死亡率較高[4]。ISO是一種合成兒茶酚胺和β腎上腺素能激動劑,廣泛用于誘導實驗性心血管疾病,在實驗動物中引起心肌嚴重應激,導致心肌梗死樣壞死[21]。ISO誘導的實驗動物心肌病理生理變化與人類AMI的病理生理變化相似[10], 且與其他動物模型相比, ISO誘導心肌損傷動物模型具有死亡率低、可重復性高等優(yōu)點[22]。因此ISO誘導的動物模型是一個容易較常使用的標準化的AMI動物模型,相關研究將其用于評價AMI藥物的療效。但目前ISO誘導心肌損傷動物模型相關研究主要集中于大鼠,給藥方式有皮下注射、腹腔注射等,具體藥物劑量不一,且小鼠相關研究較少[6-9]。故本研究探討了ISO不同給藥次數(shù)以及給藥時間對小鼠AMI模型造模程度的影響。

cTnT、CK-MB、LDH等指標是AMI發(fā)生心肌損傷的標志物[23-24], 也是評價本試驗造模成功與否的指標。據(jù)報道, ISO單次皮下注射1 d后,小鼠心臟短暫性收縮功能增強,舒張功能不變,約10%心肌細胞膜損傷,但損傷的心肌細胞很少出現(xiàn)壞死; 循環(huán)中cTnT水平升高,表明心肌細胞受到損傷[25]。本研究選取了ISO較適宜的中間劑量150 mg/kg進行研究,發(fā)現(xiàn)單次皮下給藥后小鼠血清中CK、CK-MB和LDH都在2 h出現(xiàn)了應激性的升高,隨后降低,僅LDH在16 h時出現(xiàn)2次升高。而連續(xù)2次皮下給藥除在2 h時出現(xiàn)應激性升高外, CK、CK-MB和LDH均在16 h達到了最高濃度,且2次給藥后最高濃度高于單次給藥后最高濃度。因此, 2次連續(xù)給藥的方式要優(yōu)于單次給藥。在2次給藥后16 h, 血清中cTnT、ALT和AST也顯著升高。ISO誘導的心肌梗死與人類心肌梗死具有相似的形態(tài)學改變。據(jù)報道[7], ISO誘發(fā)的心肌壞死發(fā)生在左心室心內膜下區(qū)和室間隔。本研究通過病理結果發(fā)現(xiàn), ISO刺激16 h時的小鼠心肌組織發(fā)生顯著病理學改變,室間隔厚度增加,細胞排列紊亂、疏松,心肌細胞的細胞腫脹,細胞膜溶解。上述結果表明在2次給藥方式下,選擇16 h取材優(yōu)于其他時點,此時的模型損傷指標升高更顯著、更穩(wěn)定,探究藥物治療研究的窗口更大。

相對其他造模方法, ISO皮下注射誘導AMI模型實驗操作簡單,對其他臟器無明顯毒性,無創(chuàng),動物存活率高,重復率高,缺點是不能精確定位損傷部位,但相較于其他模型顯著的實驗局限性, ISO誘導的AMI模型較為成熟穩(wěn)定[3]。本研究通過進一步探索該模型給藥次數(shù)和取材時點,發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中,連續(xù)2 d間隔24 h皮下注射150 mg/kg劑量的ISO,可以比較成功地建立小鼠AMI模型,且發(fā)現(xiàn)造模后16 h取材優(yōu)于其他時點,這為臨床研究AMI的發(fā)病進程和作用機制提供更簡易、高效的模型制備方法。