秦明珍,陳路,劉鈺,藍(lán)鳴生,呂建楠,吳無畏*

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園,廣西 南寧 530010;2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533099)

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染機(jī)體而產(chǎn)生的疾病。據(jù)聯(lián)合國(guó)發(fā)布的最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),2020年全球共有3 770萬艾滋病患者,其中新發(fā)150萬人,68萬人死于艾滋病相關(guān)疾病[1]。研究表明,應(yīng)用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療艾滋病具有良好的效果,但是隨著藥物使用規(guī)模增加以及治療時(shí)間延長(zhǎng),HIV的耐藥性也逐漸提高[2]。此外,抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物與其他藥物的聯(lián)合使用可能會(huì)引起療效降低以及不良反應(yīng),導(dǎo)致藥物相互作用升高[3]。因此,開發(fā)具有抗HIV良好療效同時(shí)副作用低的新藥在治療艾滋病難題上尤為重要。中藥因其廣譜藥效以及低副作用,廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療,研究表明中藥在治療艾滋病及其并發(fā)癥上顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中藥復(fù)方聯(lián)合西藥使用可以有效緩解艾滋病患者癥狀,提高免疫功能、改善焦慮情況等[4-5]。陳梅等[6]發(fā)現(xiàn)中藥制劑唐草片聯(lián)合西藥抗病毒治療,可以顯著提高患者CD4+T細(xì)胞水平,減少副作用發(fā)生。此外,穿心蓮、夏枯草、絞股藍(lán)等中藥也具有良好的抗HIV和治療艾滋病的效果[7-10]。

藍(lán)蓮清瘟敗毒飲方藥(簡(jiǎn)稱藍(lán)蓮方藥)是根據(jù)收集的廣西壯瑤藥抗病毒民間驗(yàn)方改進(jìn)而來的復(fù)方,包括穿心蓮、桔梗、南板藍(lán)根、黨參、夏枯草、絞股藍(lán)、黃芩、梔子和羅漢果。艾滋病屬于中醫(yī)之疫毒范疇[11]。表現(xiàn)為正氣不足,感染濕熱疫毒所致,且邪毒迅速傳內(nèi)惡化,損傷臟腑氣血,以致濕熱膠結(jié),變證叢生。治宜清熱解毒,涼血散結(jié),益氣扶正。根據(jù)中醫(yī)理論,藍(lán)蓮方藥重用南板藍(lán)根清熱解毒,涼血散結(jié),善解瘟疫時(shí)毒。穿心蓮清熱解毒,燥濕涼血。藍(lán)蓮合用為君藥,清瘟辟疫,涼血敗毒以治病因。黃芩清熱燥濕,涼血解毒,亦善清濕熱疫毒。梔子瀉火除煩,清熱利濕,涼血解毒,消腫止痛。二者既增涼血解毒之效,又引三焦?jié)駸峄鸲緩南露?使邪有出路,共為臣藥。佐以夏枯草清熱瀉火,消散郁結(jié)。黨參益氣扶正,既可扶助正氣,鼓邪外出,又能散中有補(bǔ),不致耗傷正氣;絞股藍(lán)既清熱解毒以助祛邪,又益氣健脾以助固本。諸藥合用,共奏清熱解毒,涼血散結(jié),益氣扶正之功。本方的配伍特點(diǎn)是：祛邪扶正兼顧,祛邪為主。以君藥辟疫解毒,臣藥清熱除濕,配小量補(bǔ)氣藥,祛邪不傷正,扶正不留邪。本文從藍(lán)蓮方藥的中藥成分出發(fā),依托網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法開展了藥理分析,并結(jié)合體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證方藥抗HIV病毒的潛在活性并分析其分子機(jī)制,為后續(xù)的研究和臨床應(yīng)用提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑藍(lán)蓮方藥中藥成分的來源及批號(hào)見表1;唐草片購自上海百歲行藥業(yè)有限公司(批號(hào)：201112);TZM-bl細(xì)胞、293T細(xì)胞及假病毒包裝質(zhì)粒(pNL4-3.Luc.R-E-,pVSVG)由本實(shí)驗(yàn)室保存;轉(zhuǎn)染試劑盒GenJet DNA In Vitro Transfection Reagent(美國(guó)SignaGen公司);熒光檢測(cè)試劑盒ONE-Glo Luciferase Assay System(美國(guó)Promega公司)。

表1 藍(lán)蓮方藥各中藥成分來源及批號(hào)

1.2 儀器CI-191C二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Crystal公司);Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)等。

2 方法

2.1 藥材制備分別稱取藍(lán)蓮方藥中藥粉末：南板藍(lán)根115 g、穿心蓮94 g、黃芩58 g、夏枯草115 g、絞股藍(lán)58 g、黨參115 g、桔梗58 g、梔子58 g、羅漢果180 g?；靹蚝蠹?0%乙醇回流提取兩次,將提取液抽濾后水浴蒸發(fā)除去乙醇以及多余水分,收集浸膏A。將藥渣再次提取后收集提取液并過濾,濾液蒸發(fā)濃縮到接近藥材重量1.5倍時(shí)測(cè)定相對(duì)密度和濃縮液溫度,當(dāng)相對(duì)密度=1.10時(shí),邊攪拌邊緩慢加入95%乙醇,使溶液含醇量達(dá)到70%。靜置24 h后,將上清液與抽濾后的下層混懸液合并。水浴蒸發(fā)去除乙醇和多余水分,收集浸膏B。合并浸膏A和B,混勻后4 ℃保存。

唐草片處理：稱取適量唐草片,研磨均勻后用去離子水充分溶解,過濾,4 ℃保存。

2.2 中藥有效成分和潛在靶點(diǎn)篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(https：//old.tcmsp-e.com)查詢各中藥的化學(xué)成分,根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且化合物類藥性(drug like,DL)≥0.18的屬性值篩選活性組分并獲得相關(guān)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)補(bǔ)充查找南板藍(lán)根的化學(xué)結(jié)構(gòu)組分,再將組分輸入TCMSP平臺(tái)獲取化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后,將所有蛋白質(zhì)靶點(diǎn)統(tǒng)一在Uniprot(http：//beta.uniprot.org/)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行規(guī)范化。

2.3 疾病的相關(guān)靶點(diǎn)篩選以“HIV”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.omim.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(http：//db.idrblab.net)以及DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//go.drugbank.com)分別獲取疾病的相關(guān)作用靶點(diǎn),并將靶點(diǎn)進(jìn)行合并。

2.4 生物學(xué)功能和通路富集分析將HIV和藍(lán)蓮方藥的相關(guān)靶點(diǎn)利用R語言繪制成韋恩圖,獲取兩者的交集基因。為進(jìn)一步分析藥物對(duì)HIV的分子作用機(jī)制,將交集基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org/gp/index.html),物種選擇人類(H.sapiens),進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析。保存數(shù)據(jù)結(jié)果,利用微生信平臺(tái)(http：//www.bioinformatics.com.cn)分別繪制前20條通路的生物學(xué)過程(biological prpcess,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能 (molecular function,MF)氣泡圖。采用Origin 8.0構(gòu)建KEGG富集結(jié)果柱狀圖。

2.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建運(yùn)用CytoScape 3.8.0構(gòu)建HIV與藍(lán)蓮方藥的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)CytoScape內(nèi)置分析工具“network analyze”計(jì)算網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋮?shù),由參數(shù)中位數(shù)大小篩選關(guān)鍵成分與靶點(diǎn),并分析主要的分子通路。

2.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI)是通過數(shù)據(jù)庫將已知蛋白和預(yù)測(cè)蛋白的相互作用關(guān)系以網(wǎng)絡(luò)圖呈現(xiàn)出來,對(duì)研究疾病分子機(jī)制和關(guān)鍵靶點(diǎn)有重要作用。將藍(lán)蓮方藥抗HIV的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//cn.string-db.org),得到PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過CytoScape 3.8.0對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析。

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證分子對(duì)接主要用于將小分子與蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)對(duì)接,預(yù)測(cè)分子結(jié)合位點(diǎn)并評(píng)估其互補(bǔ)分值[12]。本文通過分子對(duì)接分析主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合潛力。通過PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)獲取蛋白結(jié)構(gòu),PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取配體小分子結(jié)構(gòu),采用AutoDock Tools 1.5.6軟件對(duì)蛋白和配體結(jié)構(gòu)文件進(jìn)行去水、加氫、加電荷等預(yù)處理。利用AutoDock Vina 1.2.3將蛋白和配體分子進(jìn)行對(duì)接,結(jié)果通過Pymol軟件可視化分析。

2.8 HIV假病毒構(gòu)建采用文獻(xiàn)[13]的方法,將實(shí)驗(yàn)室保存的HIV假病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備HIV假病毒。使用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞濃度為5×105/孔,于 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。24 h后進(jìn)行質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,48 h后收集含假病毒的細(xì)胞上清,離心后置于-80 ℃冰箱凍存。

2.9 藍(lán)蓮方藥細(xì)胞毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為藍(lán)蓮方藥組、抗HIV中藥唐草片組、無藥物細(xì)胞對(duì)照組和無細(xì)胞對(duì)照組(只加培養(yǎng)基)。將藥物溶解于DMEM完全培養(yǎng)基,配制成一定濃度梯度的培養(yǎng)液。使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孵育TZM-bl細(xì)胞,每孔7 000個(gè)細(xì)胞,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換含藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。采用MTT染色法在酶標(biāo)儀上檢測(cè)細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光值,即相對(duì)光單位(relative light unit,RLU),計(jì)算細(xì)胞活力(%)=RLU(藥物組-無細(xì)胞對(duì)照組)/RLU(細(xì)胞對(duì)照組-無細(xì)胞對(duì)照組)×100%,Graphpad Prism 7軟件得出藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度CC50。

2.10 藍(lán)蓮方藥抗HIV假病毒實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為藍(lán)蓮方藥組(加藍(lán)蓮方藥與HIV假病毒),藍(lán)蓮方藥濃度分為65.625、13.125、2.625 μg·mL-1;唐草片組(加唐草片與HIV假病毒),唐草片濃度分為100、50、25 μg·mL-1;HIV假病毒對(duì)照組(只加HIV假病毒)和細(xì)胞對(duì)照組(不含HIV假病毒和藥物)。以每孔10 μL HIV假病毒液感染TZM-bl細(xì)胞,添加DMEM完全培養(yǎng)基至100 μL,培養(yǎng)48 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞熒光發(fā)光值,得到5×106RLU·mL-1的HIV假病毒感染力。將HIV與不同濃度的藥物共培養(yǎng)細(xì)胞,HIV假病毒每孔添加10 μL。TZM-bl細(xì)胞采用96孔黑色細(xì)胞培養(yǎng)板孵育,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后采用ONE-Glo Luciferase Assay System試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色,酶標(biāo)儀檢測(cè)RLU值,Graphpad Prism 7軟件計(jì)算藥物對(duì)HIV假病毒的細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50以及選擇指數(shù)SI,SI=CC50/IC50。Origin 8.0繪制藥物濃度與HIV假病毒感染率關(guān)系曲線圖,HIV假病毒感染率(%)=RLU(藥物組-細(xì)胞對(duì)照組)/RLU(HIV假病毒對(duì)照組-細(xì)胞對(duì)照組)×100%。

2.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用6孔板培養(yǎng)TZM-bl細(xì)胞,每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換含HIV或者藥物的新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組(無處理組)、HIV假病毒組(添加HIV假病毒液)、HIV+藍(lán)蓮方藥組(添加HIV假病毒液與藍(lán)蓮方藥)。培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞,根據(jù)試劑盒方法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)基因的相對(duì)表達(dá)量,數(shù)據(jù)以2-△△Ct表示。篩選KEGG富集分析的主要信號(hào)通路分子AKT1、TNF-α以及IL-17為檢測(cè)基因,內(nèi)參基因?yàn)锳ctin,基因引物由擎科生物公司合成,引物序列見表2。qRT-PCR反應(yīng)體系 20 μL,程序?yàn)椋侯A(yù)熱(95 ℃、30 s),擴(kuò)增 (95 ℃、10 s, 58 ℃、15 s,72 ℃、15 s,共40個(gè)循環(huán)),冷卻 (37 ℃、30 s)。

表2 qRT-PCR基因引物

3 結(jié)果

3.1 藍(lán)蓮方藥和HIV的靶點(diǎn)獲取經(jīng)ADME篩選并去除重復(fù)項(xiàng)之后獲得藍(lán)蓮方藥的有效成分110種。各成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)目合計(jì)并去除重復(fù)靶點(diǎn)后獲得藍(lán)蓮方藥的有效靶點(diǎn)280個(gè)。

分別從各數(shù)據(jù)庫獲得HIV的相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)為Drugbank 54個(gè)、GenCards 1 315個(gè)、OMIM 21個(gè)點(diǎn)、TTD 7個(gè),去除重復(fù)項(xiàng)后獲得靶點(diǎn)1 357個(gè)。

3.2 生物學(xué)功能和通路富集分析HIV和藍(lán)蓮方藥的共同靶點(diǎn)有135個(gè)(見圖1)。GO富集分析可闡明關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)發(fā)揮的主要生物學(xué)功能,結(jié)果見圖2。由圖2可知,關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的BP主要包括response to inorganic substance、response to bacterium、response to lipopolysaccharide等。CC主要有membrane raft、membrane microdomain、side of membrane等。MF以protein kinase binding、kinase binding、phosphotransferase activity、alcohol group as acceptor等功能較明顯。KEGG分析顯示了主要通路參與的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)數(shù)目以及P值大小,結(jié)果見圖3。由圖3可知,藍(lán)蓮方藥抗HIV的基因主要富集在Hepatitis B、PI3K-Akt signaling pathway、TNF signaling pathway、IL-17 signaling pathway等信號(hào)通路。

圖1 藍(lán)蓮方藥與HIV的靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的GO富集分析氣泡圖

圖3 關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析柱狀圖

3.3 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建藍(lán)蓮方藥與HIV的共同靶點(diǎn)所包含的藍(lán)蓮方藥有效成分為104個(gè)。將104個(gè)有效成分與KEGG分析獲取的前20條通路,通過CytoScape 3.8.0構(gòu)建藍(lán)蓮抗HIV的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)。

圖4 藍(lán)蓮方藥抗HIV的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖 注：藍(lán)色的倒三角形為不同藥物的活性成分,綠色三角形為通路,紅色四邊形為HIV和藍(lán)蓮方藥的共同靶點(diǎn)。

根據(jù)CytoScape計(jì)算的度(degree)篩選關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)。Degree值越大則圖中的節(jié)點(diǎn)(node)面積越大,表示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中可能發(fā)揮越關(guān)鍵的作用。成分的degree中位數(shù)為4,篩選degree≥8(2倍中位數(shù)),得到36種主要活性成分,包括槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、黃芩素(baicalein)等,具體見表3。靶點(diǎn)degree中位數(shù)為6,篩選degree≥12(2倍中位數(shù)),得到37個(gè)關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)。由成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖可知,一種成分可與多種靶點(diǎn)相連,一種靶點(diǎn)也可能與多種成分相關(guān),而靶點(diǎn)與通路也是多線連接的方式,提示提示藍(lán)蓮方藥抗HIV的機(jī)制可能是多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

表3 藍(lán)蓮方藥的關(guān)鍵活性成分

3.4 蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將藍(lán)蓮方藥與HIV的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,獲得蛋白PPI網(wǎng)絡(luò),用

CytoScape對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析,并篩選核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)(見圖5)。該網(wǎng)絡(luò)由135個(gè)節(jié)點(diǎn),2 837條邊組成,節(jié)點(diǎn)連接的邊越多表示該節(jié)點(diǎn)的重要性越強(qiáng),節(jié)點(diǎn)間連接線越密集,表示節(jié)點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)越密切。PPI網(wǎng)絡(luò)計(jì)算的degree值為40,篩選degree≥80(2倍中位數(shù)),得到14個(gè)節(jié)點(diǎn),91條邊的網(wǎng)絡(luò),即主要靶點(diǎn)14個(gè)。將這14個(gè)靶點(diǎn)與成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)篩選的37個(gè)靶點(diǎn)取交集,獲得7個(gè)節(jié)點(diǎn),21條邊的網(wǎng)絡(luò),即核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)7個(gè),為AKT1、TNF、CASP3、TP53、JUN、ESR1和PTGS2。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浜Y選核心靶點(diǎn)

3.5 分子對(duì)接驗(yàn)證將核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)AKT1、TNF、CASP3 、TP53、JUN、ESR1和PTGS2分別與主要活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)接結(jié)果見表4。AutoDock Vina 通過計(jì)算小分子與蛋白的結(jié)合能從而評(píng)估其相互作用強(qiáng)度,結(jié)合能<-7.0 kcal·mol-1被視為結(jié)合活性較強(qiáng)[12],結(jié)合能越小表示其結(jié)合越穩(wěn)定,相互作用越強(qiáng)。對(duì)接結(jié)果顯示,AKT1、TNF、CASP3、ESR1和PTGS2這5種主要成分與蛋白靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-7 kcal·mol-1,結(jié)合活性較強(qiáng)。將AKT1與黃芩素、TNF與槲皮素、CASP3與木犀草素的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化,如圖6。

圖6 部分成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接3D效果圖

表4 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能

3.6 藍(lán)蓮方藥的細(xì)胞毒性以及對(duì)HIV的抑制作用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7,細(xì)胞活力與藥物濃度有明顯劑量依賴性,藥物濃度越高細(xì)胞活力越低。計(jì)算得出,藍(lán)蓮方藥與唐草片對(duì)TZM-bl細(xì)胞的CC50分別為(3.16±0.18)、(2.01±0.02)mg·mL-1。且藍(lán)蓮方藥與唐草片對(duì)TZM-bl細(xì)胞的無毒濃度分別為0.21、0.38 mg·mL-1,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在無毒濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。

圖7 藍(lán)蓮方藥對(duì)細(xì)胞活力的影響曲線

藥物與HIV假病毒共培養(yǎng)細(xì)胞48 h后檢測(cè)熒光發(fā)光值,得到藥物濃度與病毒感染產(chǎn)生的熒光信號(hào)抑制曲線(見圖8),可見假病毒感染率隨著藍(lán)蓮方藥或唐草片的濃度增加而降低。經(jīng)計(jì)算得出藍(lán)蓮方藥與唐草片對(duì)HIV假病毒的IC50分別為17.10、94.42 μg·mL-1;其SI分別為184.80和21.29。

圖8 藍(lán)蓮方藥對(duì)HIV假病毒的抑制曲線

3.7 qRT-PCR檢測(cè)HIV假病毒組每組以假病毒液250 μL感染細(xì)胞,藍(lán)蓮方藥終濃度為26.25 μg·mL-1,添加DMEM完全培養(yǎng)基至2.5 mL。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后獲取各組基因qRT-PCR的Ct值,根據(jù)2-△△Ct公式,計(jì)算其他各組相對(duì)于細(xì)胞對(duì)照組的表達(dá)量。由圖9可知,與細(xì)胞對(duì)照組相比,HIV假病毒組的IL-17基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低,而AKT1以及TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高。與HIV假病毒組對(duì)比,HIV+藍(lán)蓮方藥組的IL-17表達(dá)量明顯升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

圖9 qRT-PCR檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量 注：*表示細(xì)胞對(duì)照組與HIV假病毒組比較,#表示HIV假病毒組與HIV+藍(lán)蓮方藥組比較,n=3;其中*P<0.05,**P<0.01,##P<0.01。

4 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析藍(lán)蓮方藥具有抗HIV潛在作用的化學(xué)組分,包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素等。研究發(fā)現(xiàn),槲皮素具有良好的抗HIV-1作用[14-15]。Ahn等[16]從大戟分離出的3種槲皮素和山柰酚均能抑制HIV-1整合酶活性,其中槲皮素IC50為15.7～22.7 μmol·L-1,山柰酚IC50為16.7 μmol·L-1。山柰酚-7-O-葡萄糖苷的抗HIV活性高于山柰酚,糖苷衍生物能夠利用較好的水溶性進(jìn)入組織,在HIV感染早期抑制病毒反轉(zhuǎn)錄[17]。從大翅薊提取的木犀草素對(duì)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H具有較強(qiáng)的抑制作用,IC50為12.8 μmol·L-1,純化的木犀草素還能抑制HIV-1整合酶活性[18]。Schonhofer等[19]發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠下調(diào)細(xì)胞周期素依賴性激酶9和HIV反式轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白的表達(dá),通過持續(xù)增強(qiáng)HIV潛伏期,使隱藏在CD4+T細(xì)胞中具有自發(fā)誘導(dǎo)和復(fù)制能力的病毒失活。黃芩素是一種黃酮類化合物,能與HIV-1整合酶的核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合,改變酶構(gòu)象影響酶活從而抑制HIV病毒的復(fù)制[20]。

本文分析顯示,藍(lán)蓮方藥調(diào)控HIV感染的潛在核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)為AKT1、TNF、CASP3、TP53、JUN、ESR1和PTGS2等。AKT1在巨噬細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用,過表達(dá)的AKT1促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a的磷酸化,磷酸化FOXO3a可以增加人單核巨噬細(xì)胞DNA片段化,調(diào)節(jié)HIV-1誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞凋亡[21]。艾滋病患者血清中腫瘤壞死因子TNF-α表達(dá)水平普遍增強(qiáng),陸宇紅等[22]發(fā)現(xiàn)TNF-α基因多態(tài)性與HIV感染密切相關(guān),患者的TNF-α位點(diǎn)rs1800629基因型為GA以及等位基因?yàn)锳的分布頻率顯著高于正常組,其基因多態(tài)性也影響抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后CD4+T細(xì)胞水平的恢復(fù)。CASP3可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,由HIV-1編碼的天冬氨酸激酶能激活突變型 CASP3*,通過消除HIV-1感染的細(xì)胞從而抑制病毒在SUP-T1細(xì)胞中的復(fù)制和傳播[23]。分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果也表明,槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素與靶點(diǎn)AKT1、TNF和CASP3的結(jié)合活性較強(qiáng),提示藍(lán)蓮方藥可能主要通過這幾種成分參與調(diào)控AKT1、TNF和CASP3等關(guān)鍵基因的表達(dá),從而抑制HIV-1病毒感染細(xì)胞。

通過基因富集分析發(fā)現(xiàn),藍(lán)蓮方藥抑制HIV感染細(xì)胞的信號(hào)通路主要有PI3K-Akt 信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路等。PI3K-Akt 信號(hào)通路在HIV-1的主要靶細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用,包括對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)以及壽命延長(zhǎng)、影響干擾素IRF-7向漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、介導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)等[24]。PI3K/Akt抑制劑能夠引起感染HIV-1病毒的巨噬細(xì)胞死亡,抑制病毒復(fù)制,而不影響正常細(xì)胞[25]。白細(xì)胞介素IL-17與艾滋病的發(fā)生密切相關(guān),艾滋病患者血清IL-17水平以及Th17/Treg細(xì)胞比例偏低,經(jīng)高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療后患者的IL-17水平明顯升高,Th17/Treg比例也得以恢復(fù),可見Th17和Treg細(xì)胞的失衡可能在艾滋病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[26]。qRT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)HIV假病毒處理后的細(xì)胞IL-17表達(dá)量明顯降低,而TNF-α和AKT1表達(dá)量明顯升高,表明這幾種基因與HIV病毒的感染密切相關(guān)。添加藍(lán)蓮方藥處理后的細(xì)胞,IL-17表達(dá)量與單獨(dú)HIV處理組相比顯著上升,說明藍(lán)蓮方藥可能主要通過調(diào)節(jié)IL-17信號(hào)通路來抑制HIV病毒對(duì)細(xì)胞的感染。

假病毒是一類經(jīng)過基因工程改造的,只能進(jìn)行單輪復(fù)制感染的病毒。由于HIV病毒的特殊性,直接應(yīng)用HIV病毒進(jìn)行細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室,因此很多抗HIV藥物篩選和藥物機(jī)理研究應(yīng)用了HIV假病毒來模擬真病毒的感染[27]。唐草片是目前中國(guó)唯一批準(zhǔn)用于艾滋病治療的中成藥,具有清熱解毒、活血益氣的作用[28]。因此本文應(yīng)用HIV假病毒感染細(xì)胞模型對(duì)比了藍(lán)蓮方藥和唐草片的抗病毒效果。結(jié)果顯示,與唐草片相比,藍(lán)蓮方藥抑制病毒感染的半抑制濃度IC50更小,選擇指數(shù)SI更大,且二者具有顯著性差異(P<0.5),表明藍(lán)蓮方藥抗HIV活性比唐草片更好。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,從整體角度出發(fā)分析藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián),得出藍(lán)蓮方藥抗HIV感染為多成分,多靶點(diǎn),多通路的網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制,其中藍(lán)蓮方藥對(duì)IL-17信號(hào)通路的調(diào)控可能起關(guān)鍵作用。