高建朝 王思思 張志生 張京力 李曉霞 馬 科 馮志林 周海豐 王展海

（1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院乳腺外科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院婦產科，河北 張家口 075000；3.河北北方學院附屬第一醫(yī)院檢驗科，河北 張家口 075000）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1]。新輔助化療是指對無遠隔轉移的乳腺癌患者在手術治療前，以系統(tǒng)性化療作為治療的第1步，可有效減輕術前腫瘤負擔，提高手術成功率，或變不可保乳為可保乳，變不能手術為能手術，即病理完全緩解（pathological complete response，pCR）[2-3]。有研究結果顯示，非pCR者無法從新輔助化療中獲益，且可能延誤手術時機，導致預后不良[4]。因此，尋找特異性標志物，早期預測乳腺癌新輔助化療療效及其預后具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是腫瘤領域的研究熱點，其表達水平可對多種腫瘤細胞生物學行為產生影響，可作為臨床診斷和預后評估的標志物[5]。有研究結果顯示，乳腺癌患者miR-206、miR-125、miR-21表達均明顯異常[6-7]，但是否可作為評估新輔助化療療效和患者預后的指標尚需進一步研究。為此，本研究擬探討miR-206、miR-125、miR-21在新輔助化療療效和患者預后評估中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2021年7月—2022年7月在河北北方學院附屬第一醫(yī)院診斷并接受新輔助化療的乳腺癌患者82例（乳腺癌組），均為女性，年齡36～58歲。納入標準：1）符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2017年版）》[8]中乳腺癌診斷標準；2）初治，且無遠隔轉移；3）未接受過化療和內分泌治療，可完成治療和隨訪；4）患者及其家屬均知情同意。選取同期河北北方學院附屬第一醫(yī)院健康體檢者40名作為正常對照組，均為女性，年齡29～55歲。納入標準：1）全身體檢結果正常；2）知情同意。排除標準：合并內分泌系統(tǒng)疾病、原發(fā)性血液系統(tǒng)疾病，處于妊娠期或哺乳期。本研究經河北北方學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準（202012067）

1.2 方法

1.2.1 臨床資料和樣本收集

收集所有對象的臨床資料，包括年齡、性別、體重指數(shù)、月經情況、腫瘤數(shù)量、腫瘤直徑、臨床分期、病理分級、Ki-67表達情況。采集乳腺癌患者新輔助化療前和正常對照者體檢當日的空腹靜脈血3 mL，1 096×g離心5 min，分離血清，保存待測。

1.2.2 血清miR-206、miR-125、miR-21檢測

采用TRIzol試劑（美國ThermoFisher Scientific公司）提取總RNA，將RNA用反轉錄試劑盒（湖北艾普蒂生物工程有限公司）逆轉錄成cDNA，以cDNA為模版進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。ALLin-One miRNA qPCR Kit試劑盒購自廣州復能基因有限公司，檢測儀器為ProFlex PCR儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成。U6上游引物為5'-TGCGGGTGCTCGCTICGCAGC-5'，下游引物為5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；miR-206上游引物為 5'-TGGAATGTAAGGAAGTG-3'，下游引物為5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；miR-125上游引物為5'-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3'，下游引物為5'-GCTGTCAACATACGC-TACGTA-3'；miR-21上游引物為5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，下游引物為5'-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3'。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-206、miR-125、miR-21相對表達量。

1.2.3 新輔助化療方案

采用TAC方案（多西紫杉醇75 mg/m2，多柔比星50 mg/m2，環(huán)磷酰胺500 mg/m2）進行新輔助化療。以3周為1個周期，共6個周期。參考實體瘤療效評估標準[9]，將療效分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定、進展。以完全緩解+部分緩解為化療有效，以穩(wěn)定+進展為化療無效。

1.2.4 隨訪

通過微信或電話方式對所有患者隨訪1年，隨訪終點事件為全因死亡。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用Bartlett方差齊性檢驗和Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗確認數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。等級資料采用Ridit檢驗。采用Logistic回歸分析評估乳腺癌患者新輔助化療療效的影響因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項指標判斷新輔助化療療效的效能。采用Kaplan-Meier生存曲線評估乳腺癌患者的生存情況。采用Cox回歸分析評估影響乳腺癌患者生存率的危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組和正常對照組血清miR-206、miR-125、miR-21相對表達量比較

乳腺癌組血清miR-206、miR-125相對表達量低于正常對照組（P＜0.001），血清miR-21水平高于正常對照組（P＜0.001）。見表1。

表1 乳腺癌組和正常對照組血清miR-206、miR-125、miR-21相對表達量比較

2.2 新輔助化療不同療效的乳腺癌患者臨床病理資料比較

82例乳腺癌患者新輔助化療結束后，19例完全緩解，38例部分緩解，22例穩(wěn)定，3例進展?；熡行?7例，化療無效25例。化療無效組與化療有效組之間腫瘤直徑、臨床分期、病理分級和血清miR-206、miR-125、miR-21相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他指標2個組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 乳腺癌患者新輔助化療療效的多因素Logistic回歸分析

以化療療效（化療有效=0，化療無效=1）作為因變量，將差異有統(tǒng)計學意義的項目作為自變量，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，校正腫瘤直徑、臨床分期、病理分級后，血清miR-206、miR-125低表達和miR-21高表達是乳腺癌患者化療無效的獨立危險因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為0.438、0.432、4.512，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為0.232～0.826、0.257～0.725、2.886～7.054，P＜0.05]。見表3。

表3 乳腺癌患者新輔助化療療效多因素Logistic回歸分析

2.4 血清miR-206、miR-125、miR-21對新輔助化療療效的預測價值

采用Logistic回歸分析建立聯(lián)合檢測方程：Logit（P）=0.384 42-0.577 09×miR-206-0.514 14×miR-125+0.250 89×miR-21。ROC曲線分析結果顯示，miR-206、miR-125、miR-21單項和聯(lián)合檢測判斷化療無效的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.795、0.761、0.782、0.899。見圖1、表4。

圖1 血清miR-206、miR-125、miR-21單項和聯(lián)合檢測判斷化療無效的ROC曲線

表4 血清miR-206、miR-125、miR-21新輔助化療療效預測價值

2.5 不同預后乳腺癌患者各項指標比較

82例乳腺癌患者化療后隨訪1年，有61例生存（生存組），21例死亡（死亡組）。生存組與死亡組臨床分期、病理分級和血清miR-206、miR-125、miR-21相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其他指標2個組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 死亡組和生存組各項指標比較

2.6 血清miR-206、miR-125、miR-21判斷乳腺癌患者1年死亡的效能

采用Logistic回歸分析建立聯(lián)合檢測方程：Logit（P）=0.267 71-0.500 13×miR-206-0.477 99×miR-125+0.243 86×miR-21。ROC曲線分析結果顯示，血清miR-206、miR-125、miR-21單項檢測和聯(lián)合檢測判斷乳腺癌患者1年死亡的AUC分別為0.757、0.698、0.676、0.838。見圖2、表6。

表6 血清miR-206、miR-125、miR-21判斷乳腺癌患者1年死亡的效能

2.7 不同血清miR-206、miR-125、miR-21相對表達量的乳腺癌患者1年生存率比較

根據(jù)ROC曲線得出的最佳臨界值將所有乳腺癌患者分為低表達（＜最佳臨界值）組和高表達組（≥最佳臨界值）。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，miR-206高表達組、miR-125高表達組1年生存率分別高于血清miR-206低表達組和miR-125低表達組（P＜0.05），miR-21低表達組1年生存率高于miR-21高表達組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同miR-206、miR-125、miR-21相對表達量乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.8 乳腺癌患者1年死亡的危險因素分析

以預后作為應變量（生存=0，死亡=1），以血清miR-206、miR-125、miR-21相對表達量作為自變量（＜均值賦值為1，≥均值賦值為2），進行Cox回歸分析。結果顯示，校正臨床分期、病理分級后，血清miR-206、miR-125低表達和miR-21高表達均為乳腺癌患者1年死亡的獨立危險因素[風險比（hazard ratio，HR）分別為0.438、0.437、4.240，95%CI分別為0.253～0.758、0.271～0.706、2.624～6.852，P＜0.05]。見表7。

表7 乳腺癌患者1年死亡的危險因素分析

3 討論

新輔助化療是乳腺癌治療的重要組成部分。乳腺癌患者采用新輔助化療治療達pCR后，其遠期預后較好[10]，但仍有＜5%的患者新輔助化療過程中會出現(xiàn)進展，甚至喪失手術機會[11]。故尋找可有效預測乳腺癌新輔助化療療效的生物標志物，指導個體化治療具有重大意義。

miRNA是一類短鏈非編碼RNA，通過介導靶基因mRNA降解，參與細胞分化、增殖、凋亡等，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，影響其生物學行為和耐藥的發(fā)生[12]。miR-206定位在6號染色體，可參與多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移等生物學行為[13]。覃舒婷等[7]的研究結果顯示，乳腺癌患者癌組織miR-206呈低表達，與雌激素受體呈負相關（r=-0.274，P＜0.05），且無病生存期明顯縮短。有研究結果顯示，乳腺癌患者miR-206表達與臨床特征密切相關，有望成為評估內分泌治療敏感性的指標[7，14]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清miR-206相對表達量顯著降低，miR-206可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，與文獻報道[7，14]一致；血清miR-206低表達是化療無效（OR=0.438，95%CI為0.232～0.826）和1年死亡（HR=0.438，95%CI為0.253～0.758）的獨立危險因素。有研究結果顯示，細胞周期阻滯可有效增強化療藥物對腫瘤細胞的敏感性[14-15]。細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）4是一類絲/蘇氨酸激酶，通過結合細胞周期素D，促進細胞由G1期向S期轉換，其過表達參與乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展[16]。CDK4是miR-206直接作用的靶標，miR-206或可通過作用于細胞周期關鍵因子CDK4，抑制乳腺癌細胞生長，并有效提高化療藥物敏感性，改善患者預后，但確切機制仍有待進一步探討。

miR-125包括miR-125a（染色體19q13）與miR-125b（染色體21q21.1和11q24.1），參與細胞代謝、增殖、凋亡等多過程。有研究結果顯示，乳腺癌患者癌組織和腫瘤細胞中miR-125均呈低表達，且與惡性生物學行為密切相關[17-18]。本研究結果顯示，乳腺癌患者血清miR-125相對表達量顯著降低，提示miR-125可能起抑癌基因的作用；另外，miR-125低表達還是化療無效（OR=0.432，95%CI為0.257～0.725）和1年死亡（HR=0.437，95%CI為0.271～0.706）的獨立危險因素。miR-125是原癌基因ETSI的直接靶點，其可通過調控ETSI抑制細胞增殖，將細胞周期阻滯在G1期，進而抑制腫瘤[19]。細胞周期阻滯具有一定的化療增敏作用，這可能是miR-125高表達患者在接受新輔助化療更易達到化療有效且預后更好的重要因素。也有研究結果顯示，miR-125b可通過調節(jié)乳腺癌干細胞中的側群細胞，誘導化療耐藥表型[20]。目前，miR-125在乳腺癌耐藥，尤其是新輔助化療耐藥中的具體機制尚不明確，還需對此深入研究。

miR-21是目前研究較多、與惡性腫瘤關系密切的miRNA之一。miR-21在乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等多種實體瘤中表達上調[21]，提示miR-21發(fā)揮著致癌作用，其靶基因是抑癌基因。有研究結果表明，miR-21作為一個促癌miRNA，其表達與乳腺癌患者淋巴結轉移、病理分期、增殖指數(shù)等密切相關[22]。但關于miR-21在乳腺癌新輔助化療療效及預后中的價值目前還鮮有研究。本研究結果顯示，miR-21高表達可作為乳腺癌新輔助化療無效（OR=4.512，95%CI為2.886～7.054）及1年死亡（HR=4.240，95%CI為2.624～6.852）的獨立危險因素。但miR-21參與化療抵抗的具體機制仍有待進一步研究。

本研究ROC曲線分析結果顯示，血清miR-206、miR-125、miR-21聯(lián)合檢測判斷乳腺癌患者新輔助化療無效和1年死亡的AUC分別為0.899、0.838，具有較高的診斷效能，可為乳腺癌患者新輔助化療療效的判斷和預后評估提供更有效的量化參考依據(jù)。

綜上所述，乳腺癌患者血清miR-206、miR-125、miR-21表達均異常，可作為患者接受新輔助化療療效和預后的預測指標。