覃 穎 秦麗娜△ 任曉暄 朱文蓮 王一凡

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100000；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

腸易激綜合征（IBS）［1-2］是以腹痛、腹脹為主癥，伴有反復(fù)大便異常如腹瀉、水樣便或便秘等的功能性腸道疾病，其中腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是IBS最常見的亞型。合谷與天樞分別為手陽明大腸經(jīng)、足陽明胃經(jīng)的重要穴位，陽明經(jīng)多氣多血，且兩者是同名經(jīng)，根據(jù)經(jīng)絡(luò)同氣相求理論，兩者治療胃腸道疾病均具有顯著療效。故此二穴均可用來治療IBS-D，但兩者的穴位及所屬經(jīng)絡(luò)等有差異。本實(shí)驗(yàn)以IBS-D 大鼠為模型，觀察電針合谷、天樞對Bristol 大便評分、腹部回撤反射（AWR）以及結(jié)腸肌層C-kit 和黏膜層5-HT3A 受體表達(dá)的影響，探究電針兩穴位對IBS-D 腸道痛敏和動力異常是否具有療效及有何差異?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級Wistar 孕鼠5 只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK-（軍）2016-0006。清潔飼養(yǎng)，濕度為50%左右，室溫穩(wěn)定值為（23±2）℃，自由飲水。待幼鼠出生后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、合谷組和天樞組，每組10只。除正常組外，其余均進(jìn)行模型制備，飼養(yǎng)條件相同。本實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 試藥與儀器

ER-182A 型電子秤（日本AND）、BL-420 S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限責(zé)任公司）、LH-202H型電針儀（北京禎怡科技發(fā)展公司）、毫針（0.30 mm×13 mm，北京中研太和科技有限公司），Leica RM 2235組織切片機(jī)、BARD-FOLEY 雙腔導(dǎo)尿管（美國BARD）、bx 51 顯微鏡、Anymicro DSSTM 圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus）、TB-718生物組織包埋機(jī)（湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司）、Leica ST 5020徠卡全自動組織脫水機(jī)（德國徠卡）、Leica HI 1220 烤片機(jī)。5-HT3AR 抗體、c-kit試劑盒（美國Abcam），酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG二抗、濃縮DAB 溶液（無錫傲銳東源生物科技有限公司），乙酸、液體石蠟（北京化學(xué)試劑公司），2%戊巴比妥鈉（北京歐北科技生物科技有限公司），10%中性甲醛（北京百諾威生物科技有限公司）。

1.3 模型制備

除正常組外，其他3 組進(jìn)行母嬰分離、幼鼠醋酸灌腸和結(jié)直腸擴(kuò)張（CRD）制備IBS-D 模型［3-6］。幼鼠出生2～21 d每天上午3 h母嬰分離，并在幼鼠出生8～21 d進(jìn)行醋酸灌腸刺激（具體方法：用石蠟油潤滑直徑1 mm的中心靜脈導(dǎo)管，緩慢插入幼鼠肛門，灌注量見表1）。在6 周齡時給予CRD 刺激3 次，每次間隔5 min（石蠟油潤滑6F 導(dǎo)尿管插入大鼠肛門6 cm 左右），勻速緩慢（0.5 mL/min）注水0.5 mL 擴(kuò)張結(jié)直腸，維持30 s，以發(fā)生腹部抬起為準(zhǔn)，保證模型的穩(wěn)定性。普通飼料喂養(yǎng)至8周齡。

表1 IBS-D模型幼鼠醋酸灌注量

1.4 干預(yù)方法

在第9 周兩穴位組在相應(yīng)穴位進(jìn)行電針干預(yù)。穴位選擇［7］：合谷（大鼠前肢，第2 掌骨橈側(cè)緣的中點(diǎn)處）、天樞（大鼠腹部，臍兩側(cè)旁開約5 mm）。具體操作：用黑布套固定大鼠，針刺相應(yīng)穴區(qū)，并在穴位旁開1 mm 處再刺1 針；兩針與電針儀的正負(fù)極連接，同一對正負(fù)極連接同穴區(qū)的兩針柄，疏密波，頻率為2 Hz/100 Hz，強(qiáng)度為0.1～0.3 mA，以大鼠肢體微顫動為度，共5次治療，隔日1次，每次治療20 min。模型組僅黑布套固定；正常組不予任何干預(yù)。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 Bristol便型評分 干預(yù)前后，每組隨機(jī)選6只大鼠觀察其大便性狀。根據(jù)Bristol 糞便分類法［8］分為7型：1 型為硬顆粒狀；2型為多個硬球粒粘成的團(tuán)塊狀；3 型為有褶皺和裂紋的香腸狀；4 型為較光滑的長條狀；5型為光滑的塊狀；6型為粥糊樣狀；7型為液體狀。分型數(shù)值越高表示大便性狀越稀軟。其中，1、2 型表示便秘；3、4型表示正常大便；5～7型表示腹瀉。

1.5.2 腹部回撤反射（AWR）檢測 參照并改良Al-Chaer［9］的AWR 檢測腸道痛敏，禁食不禁水8 h 后進(jìn)行操作。將直結(jié)腸擴(kuò)張球囊（自制）、微量注射泵、壓力換能器等與BL-420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接，確保連接通路的密封性。打開電腦及該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)軟件。將大鼠放至與微量注射泵同水平處固定，將石蠟油涂抹于球囊頭端并緩慢插入大鼠肛門，深度約8 cm。打開微量注射泵，勻速緩慢注水（1 mL/min），共1.5 mL，球囊擴(kuò)張時間為90 s。記錄起始收縮波的潛伏期、收縮波總個數(shù)。每只大鼠分別檢測3 次（間隔半小時以上），取其平均值，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.5.3 免疫組化法檢測結(jié)腸中5-HT3AR 和C-kit的表達(dá) 治療結(jié)束后，每組隨機(jī)處死6只大鼠，取1 cm 長的結(jié)腸組織（距肛門約8 cm 處），用4%甲醛固定結(jié)腸組織、梯度脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片。PV-6000二步免疫組化法染色：根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。組織切片為藍(lán)紫色，陽性表達(dá)物為棕褐色。分析圖像數(shù)據(jù)，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)采集，在高倍鏡下（400 倍）觀察結(jié)腸肌層C-kit 和黏膜層5-HT3AR 免疫反應(yīng)物的陽性表達(dá)，每張切片隨機(jī)取2 個視野，每組共10 個視野，測定陽性面積和累積光密度值，計(jì)算平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Bristol糞便評分比較

見表2。電針治療前，模型組、合谷組和天樞組的Bristol 評分明顯高于正常組（P＜0.01），說明造模成功。電針治療后，兩電針組的評分較模型組均明顯降低（P＜0.01）；天樞組評分較合谷組明顯降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠Bristol糞便評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠Bristol糞便評分比較（分，±s）

注：與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與合谷組比較，★★P ＜0.01。下同。

電針后3.83±0.41 5.17±0.75△△4.33±0.52▲▲3.50±0.55▲▲★★組 別正常組模型組合谷組天樞組n6666電針前3.67±0.52 5.50±0.55△△5.17±0.1△△5.17±0.75△△

2.2 各組大鼠腹部回撤反射比較

見表3。模型組較正常組的潛伏期縮短、收縮波個數(shù)增多（P＜0.01）；兩穴位組較模型組的潛伏期明顯增加、收縮波個數(shù)明顯減少（P＜0.01 或P＜0.05）；與合谷組比較，天樞組潛伏期收縮波個數(shù)無明顯變化（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腸道收縮潛伏期、收縮波個數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠腸道收縮潛伏期、收縮波個數(shù)比較（±s）

組 別正常組模型組合谷組天樞組n 10 10 10 10潛伏期（s）83.66±6.78 54.77±7.64△△75.26±8.65△▲▲75.41±6.32△▲▲收縮波個數(shù)（個）0.93±0.68 2.58±0.52△△1.28±0.66▲▲1.30±0.67▲▲

2.3 各組大鼠結(jié)腸肌層C-kit陽性表達(dá)比較

見表4、圖1。與正常組比較，其他3 組C-kit 陽性表達(dá)明顯升高（P＜0.01 或P＜0.05）；兩電針組較模型組C-kit 的陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；天樞組C-kit的陽性表達(dá)較合谷組明顯降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠結(jié)腸肌層C-kit陽性表達(dá)（免疫組化染色，400倍）

表4 各組大鼠結(jié)腸肌層C-kit、5-HT3AR陽性表達(dá)比較（×10-3，±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸肌層C-kit、5-HT3AR陽性表達(dá)比較（×10-3，±s）

組 別正常組模型組合谷組天樞組n6666 C-kit 3.31±0.99 13.44±3.15△△7.11±1.63△△▲▲5.33±1.56△△▲▲★5-HT3AR 4.01±1.31 18.66±2.11△△6.28±1.10△▲▲7.32±1.52△△▲▲

2.4 各組大鼠結(jié)腸黏膜層5-HT3AR陽性表達(dá)比較

見圖2、表4。與模型組比較，其他3 組5-HT3AR的陽性表達(dá)明顯升高（P＜0.01 或P＜0.05）；兩電針組較模型組的5-HT3AR 陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；兩電針組之間的5-HT3AR陽性表達(dá)相近（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠結(jié)腸黏膜層5-HT3AR陽性表達(dá)（免疫組化染色，400倍）

3 討 論

IBS-D 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，西醫(yī)主要是對癥治療，短期內(nèi)有效，但復(fù)發(fā)率高、依賴性強(qiáng)，有一定的副作用。針灸治療IBS-D 具有安全性高、無副作用、療效持續(xù)穩(wěn)定等優(yōu)勢，多穴組合針刺、艾灸、針灸聯(lián)合等中醫(yī)外治法已被證實(shí)對改善IBS-D癥狀具有明顯療效［10-11］。但關(guān)于單穴治療IBS-D及經(jīng)穴效應(yīng)特異性的研究并不多。本研究在針灸獲得國際廣泛認(rèn)可的前提下，以IBS-D 模型大鼠為模型，通過針刺合谷與天樞穴，探究不同穴位對IBS-D的療效及差異。

本實(shí)驗(yàn)采用Bristol 評分及免疫組化的方法，研究電針合谷與天樞穴對IBS-D 的療效差異及相關(guān)機(jī)制。合谷與天樞穴分別屬于手、足陽明經(jīng)，陽明經(jīng)多氣多血，因此兩者均有調(diào)腸活血、通絡(luò)止痛、調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動的作用。古代文獻(xiàn)將合谷列為治療痛證的要穴，在臨床上對腹痛、痛經(jīng)、胃癌痛等痛證都有一定的療效［12-14］。天樞穴可以抑制腸胃蠕動、改善因腸胃過度活動引起的腹瀉，對內(nèi)臟有很好的雙向調(diào)節(jié)作用［15-16］。

合谷與天樞穴可使IBS-D 模型大鼠的Bristol 評分降低、AWR 的潛伏期延長、收縮波個數(shù)減少，同時降低結(jié)腸肌層C-kit、結(jié)腸黏膜層5-HT3AR 的表達(dá)。但兩穴的治療效應(yīng)有其特異性，從便型評分以及結(jié)腸肌層C-kit的表達(dá)結(jié)果可看出，天樞穴對腸道動力異常的效果明顯優(yōu)于合谷穴。5-HT 是介導(dǎo)胃腸功能神經(jīng)調(diào)節(jié)的重要神經(jīng)遞質(zhì)［17］，約90%的5-HT 存在于胃腸道中，參與調(diào)節(jié)腸道蠕動反射和感覺繼發(fā)［18］。5-HT 與5-HT3R 結(jié)合可刺激胃腸道分泌，進(jìn)而影響腸道痛敏［19-20］。Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（ICC）是胃腸起搏細(xì)胞，是介導(dǎo)腸神經(jīng)系統(tǒng)和調(diào)節(jié)胃腸動力的重要信號傳遞［21］，是治療IBS的重要因子［22］。c-Kit受體是ICC基因表達(dá)的標(biāo)志物［23］，可介導(dǎo)平滑肌收縮、內(nèi)臟敏感痛等，為腸神經(jīng)系統(tǒng)和ICC提供營養(yǎng)支持。

天樞穴對IBS-D 腸道痛敏和動力異常的療效更優(yōu)，其機(jī)制可能在于天樞穴的近治作用及神經(jīng)節(jié)段支配理論。天樞穴的神經(jīng)節(jié)段支配為T6～T12［24］，與結(jié)腸的神經(jīng)節(jié)段有重合，刺激天樞可將沖動信號直接投射于大腸的神經(jīng)節(jié)段分布區(qū)。因此天樞穴對腸道功能有很好的調(diào)節(jié)作用。不同經(jīng)絡(luò)和不同神經(jīng)節(jié)段支配的穴位對腸道高敏感性與動力異常的療效確實(shí)存在特異性，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。