劉荷英，劉波，鄭洋濱，陳濤，劉寧

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.上海凡默谷信息技術(shù)有限公司，上海 200127

藥品中不可避免地存在或多或少的雜質(zhì)，雜質(zhì)的毒性直接影響到藥品的安全性，因此對藥物雜質(zhì)的毒性研究非常重要。目前藥物雜質(zhì)的毒性研究方法較多，傳統(tǒng)方法主要為各種體內(nèi)外動物試驗和細(xì)胞試驗，動物試驗是毒性研究中最準(zhǔn)確直觀的方法，但考慮到動物倫理和“3R”原則的要求，加之動物試驗的成本較高，試驗周期較長，越來越多種體外毒性研究方法用于替代動物試驗研究。細(xì)胞試驗一定程度上彌補(bǔ)了上述動物試驗的缺陷，且更能研究出藥物作用機(jī)制，近年來在毒性研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［1-3］，但細(xì)胞試驗只能反映某一方面的潛在毒性，存在片面性。隨著計算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，計算機(jī)輔助預(yù)測化合物毒性方面的應(yīng)用越來越多，其具有快速、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、易實現(xiàn)等優(yōu)點，一定程度上彌補(bǔ)了動物試驗和細(xì)胞試驗的局限性。定量結(jié)構(gòu)-性質(zhì)/活性關(guān)系（QSPR/QSAR）模型是指通過數(shù)學(xué)方法建立化合物的分子描述符與其生物性質(zhì)/活性之間的線性或非線性關(guān)系模型［4］，近年來在化合物毒性預(yù)測方面應(yīng)用廣泛［5-11］，許多國際組織和監(jiān)管機(jī)構(gòu)都支持和推動QSPR/QSAR 的運用，并認(rèn)為其可以作為動物實驗的替代方法［12］。

奧美拉唑是一種能夠有效抑制胃酸分泌的質(zhì)子泵抑制劑，用于治療十二指腸潰瘍，胃潰瘍、反流性食管炎及 Zollinger-Ellison 綜合征等［13-14］，臨床上應(yīng)用的奧美拉唑系列藥物有很多，包括注射用奧美拉唑鈉、注射用艾司奧美拉唑鈉、奧美拉唑腸溶膠囊、奧美拉唑腸溶片、奧美拉唑鈉腸溶片、奧美拉唑鎂腸溶片和艾司奧美拉唑鎂腸溶片等。《中國藥典》［15］、《英國藥典》［16］、《歐洲藥典》［17］、《美國藥典》［18］和《日本藥典》［19］均收載了奧美拉唑的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中《英國藥典》《歐洲藥典》和《美國藥典》中收載的雜質(zhì)最多，共9 個雜質(zhì)（雜質(zhì)A～I(xiàn)），此外《中國藥典》艾司奧美拉唑鈉（S 型奧美拉唑鈉）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［15］中收載了5 個雜質(zhì)（雜質(zhì)I～V），其中雜質(zhì)I 和雜質(zhì)V 分別為國外藥典中的雜質(zhì)D 和雜質(zhì)A，其他3 個雜質(zhì)結(jié)構(gòu)與國外藥典不同，本課題組前期研究了注射用奧美拉唑鈉的有關(guān)物質(zhì)，除各國藥典收載的12 個已知雜質(zhì)外，還推測了4 個未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)［20］。奧美拉唑藥物在生產(chǎn)和貯存過程中易降解產(chǎn)生雜質(zhì)［21］，更需關(guān)注其雜質(zhì)安全性問題。奧美拉唑毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大鼠長期服藥導(dǎo)致的高胃泌素血癥能引發(fā)胃癌，人類的慢性高胃泌素血癥可導(dǎo)致腸嗜鉻細(xì)胞樣細(xì)胞增生和胃體內(nèi)的類癌腫瘤，盡管概率很小［22］，但至今未發(fā)現(xiàn)奧美拉唑相關(guān)雜質(zhì)的毒理學(xué)方面報道。

ADMET Predictor 軟件可基于化合物的結(jié)構(gòu)預(yù)測其吸收、分布、代謝、排泄和毒性，并綜合判斷化合物的成藥性。本研究采用該軟件基于QSPR 模型對奧美拉唑及16 個雜質(zhì)進(jìn)行毒性預(yù)測，再采用MTT法結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察對奧美拉唑鈉及7 種雜質(zhì)進(jìn)行L-929 細(xì)胞毒性試驗研究，雜質(zhì)毒性研究數(shù)據(jù)可為奧美拉唑系列藥物的質(zhì)量安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與軟件

酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司，型號：MULTISKAN GO）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司，型號：HERACELL150i）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器有限公司，型號：XDS-1B）；自動細(xì)胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司，型號：IC1000）；渦旋混合器（意大利VELP 公司，型號：VORTEX WX）；ADMET PredictorTM 軟件（美國Simulations Plus 公司，版本：9.5.0.16）；ChemOffice 2010（美國CambridgeSoft 公司）。

1.2 對照品與試劑

奧美拉唑鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100760-201504，含量：95.2%）；雜質(zhì)A（東京化成工業(yè)株式會社，批號：N5R3G-RK，HPLC 純度：99.9%）；雜質(zhì)B（山東博洛德生物科技有限公司，批號：AML ZZZ20170501，純度：98.36%）；雜質(zhì)C［徐希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：FRIFI-LL，HPLC 純度：99.9%］；雜質(zhì)D（EDQM CS，批號：3.0）；雜質(zhì)E（北京百靈威科技有限公司，批號：LF30Q06，HPLC 純度：98.60%）；雜質(zhì)J（江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，批號：S18012901，純度：94.2%）；雜質(zhì)K（Comprison 公司，批號：31171，純度：98.06%）。

小鼠成纖維細(xì)胞（L-929，武漢大學(xué)中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心）。RPMI 完全1640basic（1×）培養(yǎng)基（含10%杭州四季清新生牛血清）（上海語純生物科技有限公司）、磷酸緩沖液（上海語純生物科技有限公司）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma 公司，細(xì)胞培養(yǎng)級）、噻唑藍(lán)（MTT，Sigma 公司）。

1.3 方法

1.3.1 ADMET Predictor 軟件方法 采用ChemOffice 2010 軟件分別繪制奧美拉唑及其16 個雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其中雜質(zhì)K 為《中國藥典》中艾司奧美拉唑鈉的雜質(zhì)Ⅲ，為一對同分異構(gòu)體的混合物，此文中分別命名為雜質(zhì)K1 和K2，奧美拉唑及其各雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)見圖1。將各化合物的結(jié)構(gòu)圖導(dǎo)出為MOL 格式文件，然后導(dǎo)入ADMET Predictor 軟件中，進(jìn)行心臟毒性、大鼠急性毒性、致癌性、肝臟不良反應(yīng)毒性和致突變性的預(yù)測，再綜合計算出毒性風(fēng)險系數(shù)。ADMET Predictor 軟件分析大部分上市藥物的毒性風(fēng)險系數(shù)預(yù)測結(jié)果≤3.3；且毒性風(fēng)險系數(shù)越大，說明毒性越大。心臟毒性通過預(yù)測化合物對hERG 鉀離子通道的半抑制濃度的log 值（pIC50）來評估，pIC50≤［5.5，6］mol/L 時，說明心臟毒性小或無；大鼠急性毒性通過預(yù)測大鼠口服給藥模型的半數(shù)致死量（LD50）來評估，預(yù)測結(jié)果≥［200，320］mg/kg 時，說明產(chǎn)生的毒性小或無；致癌性是通過預(yù)測大鼠及小鼠口服給藥模型的半數(shù)中毒劑量（TD50）來評估，大鼠的TD50值≥［4，6.5］mg·kg-1·d-1時，說明化合物對大鼠的致癌性小或無，小鼠的TD50值≥［20，35］mg·kg-1·d-1時，認(rèn)為化合物對小鼠的致癌性小或無；肝臟不良反應(yīng)是通過預(yù)測化合物是否會導(dǎo)致肝臟堿性磷酸酶（AlkPhos）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、乳酸脫氫酶（LDH）、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）這5 種肝酶水平升高來評估，肝酶水平升高表示該化合物可能產(chǎn)生肝臟不良反應(yīng)，當(dāng)化合物同時導(dǎo)致AST、ALT 和LDH 升高時，認(rèn)為化合物具有肝臟毒性；致突變性是通過預(yù)測不同沙門氏菌屬（共10 株）Ames 試驗中的致突變可能性，得出致突變性風(fēng)險系數(shù)，大部分上市藥物的致突變性風(fēng)險系數(shù)預(yù)測結(jié)果≤1，當(dāng)突變性風(fēng)險系數(shù)＞1 時，表明化合物產(chǎn)生致突變性的可能性較大。

圖1 奧美拉唑及其各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)

1.3.2 細(xì)胞毒性試驗方法 取奧美拉唑鈉和雜質(zhì)J、K 分別用培養(yǎng)基溶解，取雜質(zhì)A、B、C、D、E 分別用含0.5% DMSO 的培養(yǎng)基溶解，過濾除菌，按2倍系列梯度稀釋成不同濃度，作為供試品溶液。以最高濃度下多數(shù)細(xì)胞被殺死，而最低濃度時不會殺死細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，選擇各化合物的最終濃度區(qū)間，奧美拉唑鈉濃度為25～400 μg/mL、雜質(zhì)A、D 濃度為125～2 000 μg/mL、雜質(zhì)B 濃度為9.375～300 μg/mL、雜質(zhì)C、K 濃度為250～4 000 μg/mL、雜質(zhì)E 濃度為36.25～1 160 μg/mL、雜質(zhì)J濃度為62.5～1 000 μg/mL。同時分別取培養(yǎng)基和含0.5% DMSO 的培養(yǎng)基，作為陰性對照溶液；取含5% DMSO 的培養(yǎng)基，作為陽性對照溶液。取對數(shù)生長期的L-929 細(xì)胞消化吹打計數(shù)，稀釋細(xì)胞濃度至1×104個/mL 的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μL 細(xì)胞懸液，置CO2培養(yǎng)箱（含體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳?xì)怏w）37 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)液。取陰性對照溶液、陽性對照溶液和供試品溶液，各設(shè)至少6 孔，每孔100 μL，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。于更換培養(yǎng)液后的72 h，置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入20 μL 5 g/L 的MTT溶液（取0.5 g 噻唑藍(lán)，用100 mL 磷酸緩沖液溶解，過濾除菌），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，以570 nm為測定波長，630 nm 為參比波長，在酶標(biāo)儀下測定吸光度，以加藥組與陰性對照組的吸光度比值計算相對增殖率（RGR），以100%減去RGR 即得抑制率，再運用SPSS 19.0 軟件使用Logit 模型進(jìn)行probit 回歸分析，計算得到各化合物的半抑制濃度IC50值。

2 結(jié)果

2.1 毒性預(yù)測結(jié)果

奧美拉唑及其雜質(zhì)的毒性預(yù)測結(jié)果見表1。心臟毒性預(yù)測結(jié)果表明，奧美拉唑及其雜質(zhì)的hERG鉀離子通道的pIC50值均＜5.5 mol/L，說明無明顯心臟毒性；大鼠急性毒性預(yù)測結(jié)果表明，奧美拉唑及其雜質(zhì)的LD50值均＞320 mg/kg，說明產(chǎn)生大鼠急性毒性的可能性較??；致癌性預(yù)測結(jié)果表明，奧美拉唑和雜質(zhì)B、C、D、E、H、I、L、O、P 的大鼠TD50值均＜4 mg·kg-1·d-1，說明產(chǎn)生大鼠致癌性的風(fēng)險較高，雜質(zhì)C 的小鼠TD50值＜20 mg·kg-1·d-1，說明其產(chǎn)生小鼠致癌性的風(fēng)險較高，雜質(zhì)C 可能同時具有大小鼠致癌性，毒性較大；肝臟不良反應(yīng)預(yù)測結(jié)果表明，雜質(zhì)A可能同時引起AST、ALT 和LDH 升高，產(chǎn)生肝臟毒性的可能性較大，其他化合物產(chǎn)生肝臟毒性的可能性較小；致突變性預(yù)測結(jié)果表明，雜質(zhì)A、F、G 的致突變性風(fēng)險系數(shù)＞1，產(chǎn)生致突變毒性的可能性高。奧美拉唑及其雜質(zhì)的綜合的毒性風(fēng)險系數(shù)均＜3.3，在上市藥物毒性范圍內(nèi)，其中雜質(zhì)A、C、F、G 的毒性風(fēng)險系數(shù)高于奧美拉唑，說明其毒性比奧美拉唑大，雜質(zhì)A 的主要毒性是致突變性和肝臟毒性，雜質(zhì)C的主要毒性是大、小鼠致癌性，雜質(zhì)F、G 的主要毒性是致突變性。

表1 ADMET Predictor軟件對奧美拉唑及其雜質(zhì)的毒性預(yù)測結(jié)果

2.2 細(xì)胞毒性試驗結(jié)果

陽性對照組細(xì)胞層完全破壞，重度抑制細(xì)胞增殖。奧美拉唑鈉及雜質(zhì)A、B、C、D、E、J、K 在不同濃度下對細(xì)胞增殖的抑制率見圖2，計算的IC50值見表2，從圖表結(jié)果可知，雜質(zhì)B 對細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，IC50值最小，細(xì)胞毒性最大，雜質(zhì)C的細(xì)胞毒性最小，各化合物細(xì)胞毒性大小為雜質(zhì)B＞奧美拉唑鈉＞雜質(zhì)E＞雜質(zhì)J＞雜質(zhì)A＞雜質(zhì)K＞雜質(zhì)D＞雜質(zhì)C，僅雜質(zhì)B 的細(xì)胞毒性大于奧美拉唑鈉。

表2 奧美拉唑鈉及其雜質(zhì)的IC50測得值 μg/mL

圖2 奧美拉唑鈉及其雜質(zhì)在不同濃度下的細(xì)胞抑制率

3 討論

本研究采用ADMET Predictor 軟件進(jìn)行毒性風(fēng)險系數(shù)評估是基于統(tǒng)計來自全球藥物索引（WDI）中的2 270 個藥物分子的預(yù)測結(jié)果總結(jié)出的打分規(guī)則。打分規(guī)則里的中括號［ ］表示“軟”閾值，85%的上市藥物不違反打分規(guī)則，10%的上市藥物違反打分規(guī)則，中括號［ ］中的數(shù)據(jù)可以理解為5%的上市藥物在中括號［ ］的范圍內(nèi)。以LD50值的閾值［200,320］mg/kg 為例，若LD50值＜200 mg/kg，說明違反該打分規(guī)則，存在毒性；若LD50值在200～320 mg/kg 之間，也違反該打分規(guī)則，同樣存在毒性，但毒性更?。蝗鬖D50值＞320 mg/kg，說明不違反該打分規(guī)則，產(chǎn)生毒性的可能性小。該軟件可預(yù)測35 項毒性參數(shù)，但僅將主要的5 項參數(shù)（心臟毒性、大鼠急性毒性、致癌性、肝臟毒性和致突變性）納入毒性風(fēng)險系數(shù)的打分。肝臟毒性預(yù)測了化合物對5 種肝酶水平變化的影響，雖然僅將主要的3 種肝酶納入打分規(guī)則，但其他2 種肝酶的影響結(jié)果仍值得關(guān)注。

奧美拉唑毒性預(yù)測結(jié)果表明其可能具有大鼠致癌性，這與文獻(xiàn)［22］報道的大鼠長期服用奧美拉唑?qū)е碌母呶该谒匮Y引發(fā)胃癌結(jié)果相符。奧美拉唑預(yù)測的大鼠LD50值為584.395 mg/kg，比文獻(xiàn)［23］報道的實驗值（＞4 g/kg）更小，但根據(jù)軟件打分規(guī)則，預(yù)測的LD50值＞320 mg/kg 時，認(rèn)為產(chǎn)生大鼠急性毒性的可能性較小，因此本次預(yù)測的結(jié)果與文獻(xiàn)基本一致。雜質(zhì)K1 和K2 為一對同分異構(gòu)體，市場上僅能購買到它們的混合物，通過軟件毒性預(yù)測可分別研究其毒性，預(yù)測結(jié)果表明二者均未發(fā)現(xiàn)明顯毒性，毒性風(fēng)險系數(shù)均低于奧美拉唑。奧美拉唑及其雜質(zhì)的綜合毒性風(fēng)險系數(shù)均不高，在上市藥物毒性范圍內(nèi)，但有4 個雜質(zhì)的毒性風(fēng)險高于奧美拉唑，需警惕雜質(zhì)A 的致突變性和肝臟毒性、雜質(zhì)C 的大小鼠致癌性和雜質(zhì)F、G 的致突變性。

目前化學(xué)藥品的細(xì)胞毒性研究還沒有相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)或指導(dǎo)原則，大多參照GB/T 16886.5-2017/ISO 10993-5:2009［24］和GB/T 14233.2-2005［25］進(jìn)行研究。本研究采用以上2 個國標(biāo)中共同收載的方法，也是最常用的MTT 法，以小鼠成纖維細(xì)胞（L-929）進(jìn)行雜質(zhì)的細(xì)胞毒性研究。目前報道的奧美拉唑相關(guān)雜質(zhì)共16 個，但僅7 個雜質(zhì)能購買到純品，因此本研究僅對這7 個雜質(zhì)進(jìn)行了研究。雜質(zhì)B 的細(xì)胞毒性約為奧美拉唑鈉的2 倍，其預(yù)測的大鼠LD50值與奧美拉唑接近，但該雜質(zhì)在藥品中的含量極低，因此雜質(zhì)B 的毒性風(fēng)險不高。由于藥品中的雜質(zhì)含量極低，雜質(zhì)純品較難獲得，在進(jìn)行毒性實驗研究時會受到限制，而采用軟件進(jìn)行毒性預(yù)測僅需明確雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過軟件毒性預(yù)測結(jié)合細(xì)胞毒性研究可快速篩查藥品中微量雜質(zhì)的毒性，但需注意將雜質(zhì)的毒性與主藥同步研究進(jìn)行對比才能更準(zhǔn)確地評價藥品安全性。