石 嬌，周葉園，張 婷，吳東明，許 穎△

1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（成都 610500）；2.冕寧縣疾病預(yù)防控制中心（涼山州 615600）

下肢深靜脈血栓（lower extremity deep venous thrombosis，LDVT）是一種常見的周圍血管疾病，病變主要累及下肢深靜脈，其發(fā)病機(jī)制與靜脈壁損傷導(dǎo)致的靜脈炎、靜脈血流滯緩和血液高凝狀態(tài)等因素有關(guān)[1-2]。LDVT的發(fā)生同年齡、體重指數(shù)(body mass index，BMI）、長期吸煙等因素有關(guān)[3]。但由于其早期癥狀不明顯，導(dǎo)致診斷難度系數(shù)較高；同時(shí)部分患者因骨折、制動、炎癥反應(yīng)等因素可引起肢體疼痛或腫脹等表現(xiàn)，極易發(fā)生漏診或誤診[3]。LDVT如未得到及時(shí)有效的治療，易出現(xiàn)肺栓塞、出血、繼發(fā)深靜脈瓣膜功能不全等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的健康與生活質(zhì)量[4]，因此對其進(jìn)行早期診斷具有重要意義。

目前LDVT的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是下肢靜脈造影，但其屬于有創(chuàng)性檢查，且部分患者對造影劑過敏，導(dǎo)致下肢靜脈造影無法作為篩查手段進(jìn)行大范圍應(yīng)用[5]。隨著超聲檢查技術(shù)的發(fā)展，彩色多普勒超聲作為篩查LDVT的一種方法[6]，其診斷準(zhǔn)確率為96.25%[7]，目前已成為臨床常用的檢測方法，但因其具有滯后性，無法提前預(yù)判血栓的形成[8]?，F(xiàn)階段臨床實(shí)驗(yàn)室檢測LDVT的主要指標(biāo)有D-二聚體（D-dimer，D-D）、纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物[fibrin（-ogen） degradation products，F(xiàn)DP]、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）等。有研究[9]表明，術(shù)后短期內(nèi)并發(fā)LDVT的患者血漿Fib、D-D水平明顯升高；而未并發(fā)LDVT的患者血漿Fib、D-D水平?jīng)]有明顯變化。但Fib、D-D等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的特異性和敏感度有待提高，尚未作為篩查手段進(jìn)行大范圍應(yīng)用[10-11]。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一類熱應(yīng)激蛋白質(zhì)，參與機(jī)體正常細(xì)胞生長、分化和代謝。維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的正常細(xì)胞中也含有低量的熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α，HSP90α），以維持細(xì)胞的正常生理功能。細(xì)胞在熱刺激、炎癥等應(yīng)激條件下會啟動HSP90α的合成與釋放，以提高細(xì)胞應(yīng)對各種刺激的能力[12]，促進(jìn)細(xì)胞分泌血管生長因子和細(xì)胞基質(zhì)等成分，提供細(xì)胞損傷修復(fù)所需營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)傷口恢復(fù)[13]。本研究擬探討HSP90α在LDVT診斷中的價(jià)值，為臨床早期診斷LDVT提供更多理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019 年1 月至2021 年12 月于成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院確診為LDVT的患者81 例作為試驗(yàn)組，同時(shí)隨機(jī)選取同期于該院進(jìn)行體檢的健康體檢者81 例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合臨床多普勒超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)，即下肢靜脈腔內(nèi)有無-低-中-強(qiáng)的血栓回聲；探頭加壓后，靜脈腔不能壓閉或部分壓閉；彩色多普勒血流成像（color doppler flow imaging，CDFI）顯示靜脈腔內(nèi)無彩色血流信號或血流信號不豐富，有明顯的充盈缺損；血流頻譜不隨呼吸改變。2）試驗(yàn)組患者尚未經(jīng)過藥物治療，避免藥物對樣本檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）診斷不明確；2）合并下肢靜脈炎、下肢靜脈曲張、風(fēng)濕免疫相關(guān)疾病、消化系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、腫瘤等；3）對照組存在可引起LDVT的相關(guān)疾病。本研究經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核、批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2023CYFYIRB-BA-Jan04）。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性（表1）。

表1 兩組一般資料比較[n（%），，n=81]

表1 兩組一般資料比較[n（%），，n=81]

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1.2 試劑及儀器

HSP90α定量檢測試劑盒購自煙臺普羅吉生物科技發(fā)展有限公司；D-D測定試劑盒、FDP檢測試劑盒、Fib測定試劑盒購自美國Instrumentation Laboratory。全自動酶標(biāo)儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司，DR-200B）；全自動洗板機(jī)（Wellwash Versa）（美國Thermo Scientific，888）；全自動凝血分析儀（西班牙Werfen，ALC TOP700）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本前處理 1）HSP90α樣本處理：使用EDTA-K2 抗凝管（紫頭管）采集全血2 mL，低速離心機(jī)下離心10 min（3 500 r/min，離心半徑18.9 cm）后收集血漿樣本，備用。2）D-D、FDP、Fib樣本處理：使用枸櫞酸鈉抗凝管（藍(lán)頭管，1∶9 抗凝）采集全血2 mL，低速離心機(jī)下離心5 min（3 000 r/min，離心半徑18.9 cm）后收集血漿樣本，備用。

1.3.2 HSP90α、FDP、D-D、Fib測定 HSP90α水平測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，F(xiàn)DP、D-D水平測定采用免疫比濁法，F(xiàn)ib水平測定采用凝固法。嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的定量資料采用（）描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的定量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。采用Logistic回歸模型單因素和多因素分析各指標(biāo)對LDVT的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿HSP90α、FDP、D-D 和Fib 表達(dá)水平比較

試驗(yàn)組HSP90α水平、FDP水平、D-D水平和Fib水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 兩組血漿HSP90α、FDP、D-D和Fib水平比較[M（P25，P75），n=81]

2.2 試驗(yàn)組HSP90α 水平與指標(biāo)相關(guān)性比較

本研究將試驗(yàn)組分為0～60歲及61～100歲2個(gè)年齡段（劃分參照我國老年人年齡界定標(biāo)準(zhǔn)）。根據(jù)HSP90α檢測試劑盒說明書，將試驗(yàn)組分為＜82.06 μg/L和＞82.06 μg/L 2個(gè)亞組。利用χ2檢驗(yàn)分析血漿HSP90α水平與患者性別、年齡以及FDP、D-D、Fib各指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示：HSP90α水平與患者年齡和性別無相關(guān)性（P＞0.05）；HSP90α水平與FDP、D-D和Fib具有相關(guān)性（P＜0.05）（表3）。

表3 試驗(yàn)組 HSP90α水平與性別、年齡及FDP、D-D、Fib指標(biāo)相關(guān)性比較[n（%）]

2.3 HSP90α、D-D、FDP、Fib 對LDVT 影響的單因素和多因素分析

將HSP90α、D-D、FDP、Fib分別作為自變量，以LDVT的發(fā)生情況作為因變量進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：FDP、D-D、Fib及HSP90α指標(biāo)與LDVT的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05）。進(jìn)一步將D-D、FDP、Fib與HSP90α聯(lián)合構(gòu)建多因素Logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Fib和HSP90α可作為LDVT的獨(dú)立預(yù)測因子（P＜0.05）（表4）。

表4 HSP90α、D-D、FDP、Fib對LDVT影響的單因素和多因素分析

2.4 HSP90α、D-D、FDP、Fib 診斷效能及HSP90α診斷臨界值

通過繪制受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）進(jìn)一步分析HSP90α、FDP、D-D、Fib對于LDVT的診斷價(jià)值。ROC曲線顯示，HSP90α、FDP、D-D、Fib用于診斷LDVT的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.876、0.985、0.987、0.840（P＜0.05）。HSP90α、FDP、D-D、Fib 4 個(gè)指標(biāo)均可作為LDVT的診斷指標(biāo)，其中D-D的AUC最大，診斷效能最佳，HSP90α診斷效能優(yōu)于Fib。進(jìn)一步計(jì)算HSP90α診斷LDVT的最佳臨界值，最佳臨界值的確定采用約登指數(shù)（靈敏度+特異性-1）最大值時(shí)對應(yīng)的表達(dá)量定義，計(jì)算得出HSP90α診斷LDVT的最佳臨界值為55.55 μg/L（圖1）。

圖1 HSP90α用于診斷LDVT的ROC曲線

3 討論

流行病學(xué)研究[14]顯示，LDVT發(fā)病率呈逐年上升趨勢，血流滯緩、靜脈壁損傷和血液高凝均易導(dǎo)致LDVT的發(fā)生。LDVT患者中女性患病率（59.1%）高于男性（40.9%）[1]，且患病年齡逐漸年輕化。長期臥床患者LDVT的發(fā)病率可達(dá)31.0%[2]，40%～60%的患者術(shù)后7～14 d可發(fā)生LDVT，其中髖部骨折術(shù)后LDVT發(fā)病率高達(dá)40%～70%，即便接受抗凝治療其發(fā)病率仍達(dá)到25%～30%[3]?，F(xiàn)階段臨床用于LDVT的診斷方法主要有下肢靜脈造影、多普勒超聲；實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)主要有D-D、FDP、Fib。HSP90α屬于HSPs90家族的亞類，也屬于熱應(yīng)激反應(yīng)蛋白。當(dāng)機(jī)體受到冷、熱、缺氧、感染、腫瘤等刺激時(shí)，機(jī)體會合成大量HSP90α。本課題組在日常HSP90α檢驗(yàn)報(bào)告審核中發(fā)現(xiàn)，HSP90α在腫瘤患者和LDVT患者的血漿中表達(dá)量升高，進(jìn)一步收集LDVT患者HSP90α結(jié)果和相關(guān)臨床資料，探索并評價(jià)HSP90α作為LDVT輔助診斷指標(biāo)的意義及價(jià)值。

本研究試驗(yàn)組患者HSP90α、FDP、D-D、Fib水平均較對照組明顯增高（P＜0.05）。虞亞菲等[15]研究發(fā)現(xiàn)，D-D水平可反映體內(nèi)凝血和纖溶過程的變化，是血栓形成或溶解的重要標(biāo)志，血栓形成過程中D-D表達(dá)水平會明顯升高，這與本研究試驗(yàn)組D-D水平明顯高于對照組的研究結(jié)論一致。張玥等[16]研究表明，F(xiàn)ib、FDP是LDVT發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示LDVT患者繼發(fā)性纖溶活性增強(qiáng)，此時(shí)機(jī)體處于高凝狀態(tài)，即血栓形成時(shí)，會伴有血漿中FDP、Fib等表達(dá)水平的增高，本研究結(jié)論與張玥等[16]研究結(jié)論一致。HSP90α的升高可能與靜脈壁受損后靜脈血管內(nèi)皮受到損害，致使血管內(nèi)皮功能紊亂有關(guān)；此時(shí)凝血酶被激活，機(jī)體的凝血和抗凝血功能失衡，促使血栓形成；同時(shí)遠(yuǎn)端血液回流受阻，導(dǎo)致遠(yuǎn)端靜脈壓力升高，毛細(xì)血管滲透壓增高，血管內(nèi)液滲透至組織間隙，致肢體腫脹、缺氧、發(fā)熱并伴有炎性因子的釋放[17-18]，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激情況時(shí)，會啟動HSP90α的合成和釋放，以提高細(xì)胞應(yīng)對各種刺激的能力[12]，促進(jìn)細(xì)胞分泌血管生長因子和細(xì)胞基質(zhì)等成分，提供細(xì)胞損傷修復(fù)所需營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)傷口恢復(fù)[13]。

本研究單因素logistic回歸分析顯示，F(xiàn)DP、D-D、Fib和HSP90α均與LDVT的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05），F(xiàn)DP表達(dá)量越高，發(fā)生LDVT的概率越大，其次為Fib、D-D和HSP90α。多因素logistic回歸分析顯示， Fib、HSP90α是LDVT發(fā)生的危險(xiǎn)因素，二者可作為LDVT的獨(dú)立預(yù)測因子。楊勇等[19]研究報(bào)道，D-D診斷LDVT的敏感度為86.6%～98.0%，特異度為54.6%～58.6%，血漿D-D是體內(nèi)交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶作用下降解片段中的特異產(chǎn)物，其含量升高可反映繼發(fā)性纖溶活性增強(qiáng)，是體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的指標(biāo)之一，在被纖溶系統(tǒng)溶解時(shí)將釋放至血液循環(huán)系統(tǒng)[20]。LDVT形成時(shí)，機(jī)體處于高凝狀態(tài)，會導(dǎo)致血漿D-D水平增高，本研究中D-D對LDVT具有較高診斷價(jià)值的結(jié)論與楊勇等[19]研究一致。丁紅輝[21]研究指出，F(xiàn)DP是血栓形成和高凝狀態(tài)的重要臨床指標(biāo)，F(xiàn)ib可反映血液黏稠度，當(dāng)機(jī)體形成的血栓處于高凝狀態(tài)時(shí)，血漿中FDP、Fib水平會明顯升高，促進(jìn)紅細(xì)胞聚集，降低血液流動性[22]，可作為診斷LDVT的指標(biāo)，這與本研究中Fib、FDP對LDVT具有較高診斷價(jià)值的結(jié)論相一致。本研究ROC曲線顯示，HSP90α用于診斷LDVT的AUC為0.876（P＜0.05），且診斷LDVT的最佳臨界值為55.55 μg/L。既往研究中，尚未發(fā)現(xiàn)血漿中HSP90α表達(dá)水平與LDVT相關(guān)的報(bào)道。

綜上所述，HSP90α表達(dá)水平在LDVT患者血漿中顯著升高，可作為LDVT的獨(dú)立預(yù)測因子，因此檢測血漿中HSP90α水平對LDVT具有重要的臨床診斷價(jià)值。但具體的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究，未來將深度探究影響血漿中HSP90α水平變化的機(jī)制，為LDVT的精準(zhǔn)診斷提供依據(jù)。