郭鴻雁 李軍

基金項(xiàng)目：

2020年寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（No.2020BFG03002）。

作者簡(jiǎn)介：

郭鴻雁（1967—），女，漢族，本科，正高職高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴庨_(kāi)發(fā)方面的研究。E-mail：1197689256@qq.com

通信作者：

李軍（1982—），男，漢族，博士在讀，副教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及開(kāi)發(fā)方面的研究。E-mail： lijunamy@126.com

【摘? 要】

目的：建立苦豆子凝膠薄層色譜鑒別方法。方法：以槐定堿和苦參堿為對(duì)照品，以碘化鉍鉀試液為顯色劑，優(yōu)化不同供試品制備方法、展開(kāi)劑、點(diǎn)樣量等薄層色譜條件，考察不同薄層板、溫度和濕度對(duì)苦豆子凝膠薄層色譜的影響，確定苦豆子凝膠劑的薄層色譜條件。結(jié)果：采用薄層色譜硅膠G板，甲醇溶解制備供試品溶液，點(diǎn)樣量2～3 μL，二氯甲烷-甲醇-氨水（50∶6∶1）為展開(kāi)劑，薄層色譜圖顯示斑點(diǎn)清晰，分離度較好。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便可行、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確、安全可靠，可作為苦豆子凝膠的薄層鑒別方法，制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

【關(guān)鍵詞】

苦豆子；凝膠；槐定堿；苦參堿；薄層色譜

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）22-0042-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322011

Study on the Identification of Sophora alopecuroides gel by Thin-layer Chromatography

GUO Hongyan? LI Jun*

College of Ningxia Vocational and Technical， Ningxia Research Center for the Development and

Utilization of Chinese Herbal， Yinchuan 750021， China

Abstract：

Objective To establish the thin-layer chromatography（TLC）identification method of Sophora alopecuroides gel. Methods Sophoridine and matrine were used as reference substances and bismuth potassium iodide test solution was used as color spreading agent to optimize the best TLC conditions of Sophora alopecuroides gel， and several factors were investigated， including different sample preparation methods， spreading solvents and sample amounts. Different manufacturers thin layer plates， different temperatures and different humidity were investigated to influence of Sophora alopecuroides gel by Thin-layer chromatography. Results The test solution of Sophora alopecuroides gel was extracted by methanol， the sample size was 2-3 μL. The spreading solvent was dichloromethane-methanol-ammonia （50∶6∶1）. The chromatographic spots were clear， without interference and easy to recognize. Conclusion The method is simple， feasible， specific， reproducible， safe and reliable. It can be used as a TLC identification method to formulate the qualitative standard of Sophora alopecuroides gel.

Keywords：

Sophora alopecuroides; Gel; Sophoridine; Matrine; Thin-layer Chromatography

苦豆子（Sophora alopecuroides L.） 是豆科槐屬多年生半灌木植物，別名苦豆草、苦豆根、苦甘草，主產(chǎn)于寧夏、內(nèi)蒙古、新疆、山西、陜西和甘肅等干旱荒漠地區(qū)［1-2］。主要成分為有生物堿、黃酮、揮發(fā)油和氨基酸等，生物堿包括槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦豆堿和金雀花堿等［3］，其中槐定堿和苦參堿含量最高。由于其較高的藥用價(jià)值和生態(tài)功能，具有廣闊的應(yīng)用前景。有研究［4-7］表明，苦豆子具有清熱解毒、抗菌消炎、止痛殺蟲(chóng)、燥濕止痢等作用。目前國(guó)內(nèi)以苦豆子為原料開(kāi)發(fā)的制劑主要有克瀉靈片、婦炎栓、苦參素注射液、苦參素膠囊、復(fù)方苦豆子口腔潰瘍復(fù)合膜等［8］，使其廣泛應(yīng)用于臨床。本研究團(tuán)隊(duì)基于苦豆子總堿具有較強(qiáng)的抑制痤瘡丙酸桿菌作用及抗炎活性，以期開(kāi)發(fā)一種用于治療防治痤瘡、粉刺、膿皰等病癥的苦豆子凝膠，該制劑質(zhì)地細(xì)膩，附著性強(qiáng)，刺激性小，有良好的應(yīng)用價(jià)值。

為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鑒別項(xiàng)的內(nèi)容，參考2020年《中國(guó)藥典》中藥及制劑鑒別的薄層色譜法［9］與相關(guān)文獻(xiàn)［10-13］，本研究?jī)?yōu)化了供試品制備方法、展開(kāi)劑、點(diǎn)樣量等色譜條件，完成了專(zhuān)屬性和不同溫濕度、不同薄層板的耐用性等方法學(xué)驗(yàn)證，建立了苦豆子凝膠劑的薄層色譜鑒別法，為制定該凝膠劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? XP205電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；DHG-9070A恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；明澈-D 24超純水系統(tǒng)（美國(guó)默克密理博有限公司）；200 mm×200 mm薄層色譜雙槽展開(kāi)缸（上海信儀儀器廠）。

1.2? 材料? 硅膠G薄層板（青島海洋化工有限司，批號(hào)：20210418）、高效硅膠HSG板（煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：20211013）、硅膠G薄層板（青島海勝精細(xì)硅膠化工有限公司，批號(hào)：20210814），二氯甲烷、甲醇、氨水、乙酸乙酯、冰醋酸、碘化鉀、堿式硝酸鉍鉀等試劑均為分析純，純化水為自制?；倍▔A（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110784-201706）和苦參堿（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110805-202010）?；倍▔A1.111mg/mL、苦參堿1.540mg/mL。中試三批苦豆子凝膠（批號(hào)2022092701、2022112501、2022112502）為委托銀川鳳儀堂生物工程有限公司制備，不加苦豆子總堿的空白凝膠陰性對(duì)照為寧夏中藥材開(kāi)發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心自制。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 溶液配制

2.1.1? 制劑及原料供試品的制備? 分別取三批苦豆子凝膠三支，分別稱(chēng)取0.2 g加甲醇25mL溶解過(guò)濾，收集濾液，備用；稱(chēng)取0.1 g苦豆子總堿加甲醇50mL溶解過(guò)濾，收集濾液，備用。

2.1.2? 對(duì)照品溶液制備? 分別精密稱(chēng)取槐定堿和苦參堿對(duì)照品加甲醇定容至10mL，制備1.111mg/mL的槐定堿和1.540mg/mL苦參堿。

2.1.3? 陰性對(duì)照溶液制備? 取自制的不含苦豆子總堿空白凝膠劑，按2.1.1項(xiàng)下制制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.4? 碘化鉍鉀試液制備? 取堿式硝酸鉍鉀0.85g，加冰醋酸10mL與水40mL溶解后，加4%碘化鉀溶液5mL，加冰醋酸20mL，用水稀釋至100mL，搖勻，備用。

2.2? 試驗(yàn)方法? 參照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)［9］，吸取供試品溶液2～3 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水（50∶6∶1）為展開(kāi)劑，飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.3? 薄層色譜條件的優(yōu)化

2.3.1? 展開(kāi)劑的選擇? 吸取苦豆子凝膠和苦豆子總堿供試品、槐定堿和苦參堿對(duì)照品溶液各2 μL分別點(diǎn)于3個(gè)同一硅膠G薄層板上，分別以A［二氯甲烷∶甲醇∶氨水（50∶6∶1）］，B［乙酸乙酯∶乙醇∶氨水（50∶1∶0.5）］，C［三氯甲烷∶甲醇∶石油醚∶氨水（50∶5∶1∶1）］為展開(kāi)劑，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果顯示，A與C作為展開(kāi)劑，凝膠和苦豆子總堿供試品與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好，效果最佳。B展開(kāi)效果欠佳。由于三氯甲烷的毒性較大，考慮安全環(huán)保。故選用A［二氯甲烷∶甲醇∶氨水（50∶6∶1）］作為展開(kāi)劑。結(jié)果如圖1。

2.3.2? 供試品制備方法的考察? 分別按照以下4種方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。①稱(chēng)取苦豆子凝膠0.2 g，加入純化水超聲溶解，定容至25mL，濾過(guò)，得供試品溶液1。②稱(chēng)取苦豆子凝膠0.2 g，5滴10%CaCl2，搖勻后加入純化水超聲溶解，定容至25mL，濾過(guò)，得供試品溶液2。③稱(chēng)取苦豆子凝膠0.2 g，加入甲醇超聲溶解，定容至25mL，濾過(guò)，得供試品溶液3。④稱(chēng)取苦豆子凝膠0.2 g，加入5滴10%CaCl2，搖勻后加入甲醇超聲溶解，定容至25mL，濾過(guò)，得供試品溶液4。結(jié)果表明∶ 4種方法制備的供試品溶液主斑點(diǎn)與對(duì)照品溶液斑點(diǎn)的顏色、位置相同，均有較好的分離度。故供試品溶液制備方法選擇簡(jiǎn)單、易操作的第3種。如圖2所示。

2.3.3? 不同點(diǎn)樣量的選擇? 選用硅膠G薄層板，取樣品溶液1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL分別點(diǎn)樣，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果顯示：對(duì)照品溶液和供試品溶液點(diǎn)樣量在1～6 μL范圍內(nèi)，均能分離，各斑點(diǎn)清晰，其中1～3 μL分離度較好，考慮不同制劑含量差異，故選擇點(diǎn)樣量為2～3 μL。結(jié)果如圖3所示。

2.4? 苦豆子凝膠薄層色譜鑒別的方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1? 專(zhuān)屬性考察? 分別吸取2批次的苦豆子凝膠供試品溶液、苦豆子總堿溶液、陰性對(duì)照溶液、混合對(duì)照品溶液各3 μL分別點(diǎn)與同一硅膠G薄層板上，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。供試品、苦豆子總堿與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好。而陰性樣品溶液無(wú)干擾。說(shuō)明該薄層色譜鑒別方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。結(jié)果如圖4所示。

2.4.2? 薄層色譜方法耐用性考察

2.4.2.1? 不同廠家硅膠G薄層板的考察? 分別在3個(gè)不同生產(chǎn)廠家硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司、煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司、青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司）點(diǎn)樣3個(gè)批次供試品及槐定堿和苦參堿對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果在3個(gè)不同品牌的硅膠G薄層預(yù)制板上，樣品色譜中在與槐定堿、苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度良好。表明不同廠家生產(chǎn)硅膠G薄層板對(duì)薄層色譜鑒別方法無(wú)明顯影響。結(jié)果如圖5所示。

2.4.2.2? 不同溫度的考察? 在同一廠家薄層硅膠G板上點(diǎn)樣3個(gè)批次供試品及槐定堿和苦參堿對(duì)照品，在10 ℃、20 ℃、35 ℃3個(gè)不同溫度下，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果展開(kāi)樣品色譜中在與槐定堿、苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好。表明不同溫度的對(duì)薄層鑒別無(wú)影響。結(jié)果如圖6所示。

2.4.2.3? 不同濕度的考察? 在同一廠家薄層硅膠G板上點(diǎn)樣3個(gè)批次供試品及槐定堿和苦參堿對(duì)照品，在32%、58%、88% 3個(gè)不同濕度下，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果展開(kāi)樣品色譜中在與槐定堿、苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。表明不同濕度對(duì)薄層色譜鑒別方法基本無(wú)影響。結(jié)果如圖7所示。

3? 討論

本研究建立苦豆子凝膠薄層鑒別方法，確定以槐定堿和苦參堿為對(duì)照品，以甲醇為溶劑制備供試品溶液，點(diǎn)樣量2～3 μL，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水=50∶6∶1為展開(kāi)劑，飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液，日光下檢視。

苦豆子凝膠劑作為新開(kāi)發(fā)的用于防治痤瘡的制劑，其主要有效成分為槐定堿和苦參堿，且兩者的含量最高，故薄層色譜鑒別選擇槐定堿和苦參堿為對(duì)照品［14］。薄層色譜鑒別是中藥制劑鑒別的主要方法之一，因其設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便而被廣泛應(yīng)用［15］，但易受供試品制備方法、點(diǎn)樣量，展開(kāi)劑等相關(guān)條件影響［16-17］。因此，本研究?jī)?yōu)化了上述條件，確定了供試品制備用甲醇溶解，點(diǎn)樣量為2～3 μL。由于三氯甲烷毒性較大，考慮實(shí)驗(yàn)人員的安全性和環(huán)保問(wèn)題［18-19］，改用二氯甲烷，并進(jìn)行了展開(kāi)劑比例的優(yōu)化調(diào)整，最終以二氯甲烷：甲醇：氨水（50∶6∶1）為展開(kāi)劑，薄層色譜分離效果最好，且低毒安全，這也符合目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的基本要求［20］。作者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)樣后薄層板再展開(kāi)之前必須進(jìn)行充分飽和，至少30 min，防止薄層色譜圖產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。可能的原因是充分飽和后，使展開(kāi)缸中的展開(kāi)劑氣、液、固三相比例適當(dāng)，斑點(diǎn)分離度較好［21］。

為了考察方法的專(zhuān)屬性和耐用性，分別考察了陰性對(duì)照溶液、不同溫度、不同濕度、不同廠家生產(chǎn)的硅膠G板等對(duì)所建立的苦豆子凝膠薄層色譜鑒別方法的影響。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照、不同溫濕度和不同廠家薄層板的3批苦豆子凝膠供試品的色譜圖均與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)位置上顯相同的顏色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好，效果佳，陰性無(wú)干擾。

本研究建立的苦豆子凝膠薄層色譜鑒別法操作簡(jiǎn)便可行、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，所用試劑安全環(huán)保，是控制苦豆子凝膠制備工藝、產(chǎn)品質(zhì)量的快速檢測(cè)方法，為制定苦豆子凝膠劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］

邢世瑞. 寧夏中藥志［M］. 銀川：寧夏人民出版社， 2006：130.

［2］李軍， 郝彩琴， 冷曉紅. 苦豆草生物堿的酶法提取工藝優(yōu)選［J］. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥， 2017， 26（6）：20-21.

［3］權(quán)丹妮， 徐玥， 曲卓，等. 寧夏苦豆子主要活性成分及治療肝臟疾病的研究進(jìn)展［J］. 藥學(xué)實(shí)踐雜志， 2022， 40（1）： 1-5.

［4］李志君， 崔生玲， 張?chǎng)?，? 苦豆子提取物對(duì)多重耐藥大腸桿菌的體外抑菌作用［J］. 中國(guó)獸藥雜志， 2022， 56（11）：10-16.

［5］蘇永霞， 蘇日拉格， 沙日扣，等. 苦豆子生物堿抗小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用研究［J］. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2022， 43（7）：33-38.

［6］游菁菁，李月英，沙碧瑩，等. 中藥苦豆子生物堿的研究進(jìn)展［J］. 江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 27（2）：109-113.

［7］穆榮娟. 7種苦豆子生物堿對(duì)豆蚜Aphis Craccinora Koch幾種酶系的影響［D］. 咸陽(yáng)：西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2014.

［8］楊巧麗， 顧政一， 黃華. 中藥苦豆子的研究進(jìn)展［J］. 西北藥學(xué)雜志， 2011， 26（3）： 232-236.

［9］國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：59.

［10］冷曉紅， 馬玲， 王俊卿，等. 苦豆草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)， 2011， 12（4）：285-288.

［11］郭鴻雁， 冷曉紅， 陳海燕，等.苦豆子植物的薄層色譜鑒別［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2013， 31（8）：1621-1622.

［12］POOLE C F， DIAS N C. Practitioners guide to method development in thin-layer chromatography［J］. J Chromatogr A， 2000， 892（1-2）：123-42.

［13］GU X， JIN Y， DONG F，et al. Toward rapid analysis， forecast and discovery of bioactive compounds from herbs by jointly using thin layer chromatography and ratiometric surface-enhanced Raman spectroscopy technique［J］. J Pharm Biomed Anal， 2018， 10（153）：9-15.

［14］曹亞軍. 復(fù)方苦豆子顆粒的薄層色譜鑒別［J］. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2006， 5（2）： 206.

［15］余利珊， 王凌， 劉羽龍. 小兒辛溫外洗散劑顯微鑒別和薄層色譜研究［J］. 中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育， 2021， 19（16）： 148-150.

［16］劉柳毅，劉麗君， 紀(jì)秋鳳，等.復(fù)方苓桂顆粒薄層色譜鑒別研究［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥， 2022， 31（5）：52-57.

［17］吉林芳， 楊德泉， 佘永紅，等.牛白藤飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥， 2022， 29（11）：4-6.

［18］張靜. 甘肅省6種地方習(xí)用藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［D］. 蘭州：蘭州大學(xué)， 2020.

［19］孫曉琦. 清熱瀉火合劑制備工藝和質(zhì)量控制研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)， 2020.

［20］劉立輝， 常華， 周艷林，等.大山楂片薄層色譜鑒別方法的改進(jìn)［J］.食品與藥品， 2021， 23（5）：411-415.

［21］辛?xí)苑迹?劉特津， 胡玉良，等. 槐花顆粒中主要成分的薄層色譜法研究［J］. 抗感染藥學(xué)， 2022， 19（2）：169-173.

（收稿日期：2023-02-23? 編輯：劉? 斌）