張文霞 康亞男

基金項(xiàng)目：

作者簡介：

張文霞（1984—），女，漢族，本科，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：zmtg2018@yeah.net

通信作者：

康亞男（1989—），女，漢族，本科，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：1962628419@qq.com

【摘? 要】

目的：采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝。方法：建立HPLC測(cè)定鞣花酸含量，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（15：85）；檢測(cè)波長為254 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為 30 ℃；采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)甲醇濃度、提取時(shí)間、液料比3個(gè)因素進(jìn)行考察，優(yōu)選鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝。結(jié)果：優(yōu)選所得的鹽覆盆子中鞣花酸提取工藝為甲醇濃度73%、提取時(shí)間63 min、液料比60∶1，此條件下鞣花酸含量為0.353%。結(jié)論：本試驗(yàn)優(yōu)選所得的提取工藝高效穩(wěn)定、操作簡易、可用于鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取。

【關(guān)鍵詞】

鹽覆盆子；鞣花酸；響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化

【中圖分類號(hào)】R284.2??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）22-0038-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322010

Optimization of Extraction Process of Ellagic Acid from Salt Rubus chingii Hu by Response Surface Methodology

ZHANG Wenxia? KANG Yanan*

Dezhou Lingcheng District Hospital of Traditional Chinese Medicine， Dezhou 253500，China

Abstract：

Objective To optimize the extraction process of ellagic acid from Raspberry salina by central composite design response surface methodology. Methods HPLC was established to determine the content of ellagic acid. The mobile phase was acetonitrile -0.2% phosphoric acid solution （15∶85）; The detection wavelength is 254 nm， the flow rate is 1.0 mL·min-1， and the column temperature is 30 ℃; Three factors， methanol concentration， extraction time and liquid to material ratio， were investigated by central composite design response surface methodology to optimize the extraction process of ellagic acid， an effective component of salt raspberry. Results The optimum extraction process of ellagic acid from salt raspberry is that the concentration of methanol is 73%， the extraction time is 63 min， and the ratio of liquid to material is 60∶1. Under this condition， the content of ellagic acid is 0.353%. Conclusion The optimized extraction process is efficient， stable and easy to operate. It can be used for the extraction of ellagic acid， an effective component of raspberry salt.

Keywords：

Salt Rubus chingii Hu; Ellagic Acid; Response Surface Method; Process Optimization

覆盆子又名樹倭泡、樹莓、掌葉覆盆子，為薔薇科植物華東覆盆子（Rubus chingii Hu）的干燥果實(shí)［1］，一般在夏初果實(shí)由綠變綠黃時(shí)采收。覆盆子收載于2020版《中國藥典》，味甘、酸，性溫，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目功效，主要防治陽痿早泄、遺尿尿頻、遺精滑精、目暗昏花［2］。覆盆子含有黃酮、酚酸、萜類等成分［3-4］，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫力等作用［5-7］，其藥用既有生品，也有鹽制品。據(jù)報(bào)道［8-9］，鞣花酸具有改善腎小管損傷及腎纖維化活性作用，覆盆子鹽炙后補(bǔ)腎固澀作用顯著增強(qiáng)，可能與鹽炙后鞣花酸含量顯著升高有關(guān)。目前，對(duì)鹽炙品中鞣花酸的提取工藝研究還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以鞣花酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝，以期為鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取提供依據(jù)。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? LC-2030C3D Plus高效液相色譜儀（島津公司）；Agilent Extend C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）（安捷倫科技有限公司）；DF110電子天平（佑科儀器儀表公司）。

1.2? 材料? 鞣花酸（批號(hào)：111959-201708）購自中國藥品生物制品檢定所；覆盆子購于江西（批號(hào)20200426），經(jīng)本院藥劑科康亞男主管藥師鑒定為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果實(shí)。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 鹽覆盆子中鞣花酸的含量測(cè)定

2.1.1? 對(duì)照品溶液制備? 精密稱取鞣花酸對(duì)照品10.50 mg，置50 mL容量瓶中，加73%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為0.21 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.2? 供試品溶液制備? 精密稱定鹽覆盆子粉末（過四號(hào)篩）1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入73%甲醇60 mL，稱定重量，回流提取63 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3? 色譜條件? 采用Agilent Extend C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液（15：85）為流動(dòng)相；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖如圖1。

2.2? 方法學(xué)考察

2.2.1? 線性關(guān)系? 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL置10 mL的容量瓶中，加入73%甲醇定容至刻度。按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定分析，以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣濃度X計(jì)算回歸方程，得回歸方程Y=2.436X+0.023（r=0.9996），表明在質(zhì)量濃度0.0021～0.21 mg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2? 精密度試驗(yàn)? 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果鞣花酸峰面積RSD為1.41%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取鹽覆盆子供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h內(nèi)進(jìn)樣分析，結(jié)果鞣花酸峰面積RSD為1.83%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4? 重復(fù)性試驗(yàn)? 取鹽覆盆子，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鞣花酸平均含量為0.349%，RSD為0.69%，表明所建立的方法重復(fù)性好。

2.2.5? 加樣回收率試驗(yàn)? 取鹽覆盆子0.5 g，平行6份，按照1∶1的比例加入鞣花酸對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并計(jì)算回收率。結(jié)果鞣花酸平均加樣回收率為101.24%，RSD為1.68%。

2.3? 響應(yīng)面法優(yōu)化鞣花酸提取工藝

2.3.1? 單因素考察? 以鞣花酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)甲醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%）、提取時(shí)間（30 min、45 min、60 min、75 min、90 min）、液料比（10∶1、25∶1、50∶1、75∶1、100∶1）進(jìn)行考察。結(jié)果見圖2，由圖2可知，以70%的甲醇、回流提取60 min，50∶1液料比提取效果最佳。

2.3.2? 響應(yīng)面設(shè)計(jì)? 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇甲醇濃度、提取時(shí)間、液料比為考察因素，利用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)鞣花酸的提取條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表1和表2。

2.3.3? 方差分析? 方程回歸分析及方差分析結(jié)果見表3。鞣花酸含量對(duì)甲醇濃度、提取時(shí)間、液料比的回歸方程為：Y=0.35+0.008A+0.009B+0.031C+0.004AB+0.016AC-0.014BC-0.028A2-0.008B2-0.023C2。結(jié)果顯示，在設(shè)定的區(qū)域內(nèi)，所建立的模型達(dá)到極顯著水平（P<0.0001），其中二次項(xiàng)中A2和C2的P值均達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），表明方程擬合較好。

2.3.4? 響應(yīng)面分析? 應(yīng)用 Design-Expert 9.0.4 軟件繪制出所考察指標(biāo)與影響較顯著的3個(gè)自變量的等高線圖，具體如圖3所示。結(jié)果最佳提取工藝為：甲醇濃度73.32%、提取時(shí)間62.87 min、液料比58.76∶1，預(yù)測(cè)鞣花酸含量為0.355%。

2.2.5? 試驗(yàn)驗(yàn)證? 考慮到實(shí)際操作的方便可行性，將條件修正為：甲醇濃度73%、提取時(shí)間63 min、液料比60∶1，此條件下鞣花酸含量為0.353%，與預(yù)測(cè)值無顯著差異，表明方程與實(shí)際情況擬合良好。

3? 討論

3.1? 目標(biāo)成分的選擇? 研究顯示，鞣花酸藥理作用廣泛，既有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)菌生長等活性，還具有改善腎小管損傷及腎纖維化作用，是覆盆子鹽炙后補(bǔ)腎固澀作用增強(qiáng)的主要相關(guān)活性成分［8-9］。因此，本試驗(yàn)選擇鞣花酸為目標(biāo)成分進(jìn)行工藝優(yōu)化。

3.2? 優(yōu)化方法的選擇? 響應(yīng)面法是一種通過回歸方程來擬合各因素水平與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，可精準(zhǔn)預(yù)測(cè)任一條件組合下的響應(yīng)值并直觀地看出函數(shù)關(guān)系的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于中藥有效成分的提取工藝優(yōu)化［10］。因此，本試驗(yàn)選擇響應(yīng)面法優(yōu)選鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝。

3.3? 流動(dòng)相的選擇? 本試驗(yàn)考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-酸水、甲醇-酸水等不同液相條件，結(jié)果顯示，以乙腈-0.2%磷酸水為流動(dòng)相時(shí)，鞣花酸的峰形及分離度最好，這可能和鞣花酸是多酚二內(nèi)酯結(jié)構(gòu)有關(guān)，加入酸水可抑制其水解，從而改善峰形、增加分離度。

綜上，鞣花酸是覆盆子鹽制后補(bǔ)腎固澀作用增強(qiáng)的主要活性化合物。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得的鹽覆盆子中鞣花酸最佳提取工藝為：甲醇濃度73%、提取時(shí)間63 min、液料比60∶1，此條件下鞣花酸含量為0.353%，所建立的方法可為鹽覆盆子有效成分的提取工藝研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］

國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典（一部）［S］. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020：382.

［2］李熠雯， 周燕霞. 覆盆子及其制劑的質(zhì)量控制研究進(jìn)展［J］. 廣州化工， 2020， 48（19）：36-37.

［3］孫乙銘， 許壽增， 俞春英， 等. 覆盆子成熟過程顏色表征及其與品質(zhì)指標(biāo)消長的相關(guān)性研究［J］. 中國中藥雜志， 2021，46（6）：1379-1385.

［4］鄧俊杰. HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)在覆盆子指紋圖譜建立和化學(xué)成分歸屬中的應(yīng)用［J］. 海峽藥學(xué)， 2020， 32（5）：23-26.

［5］陳青青， 李柯， 唐曉清， 等. 華東覆盆子果、莖與葉的酚類成分及抗氧化活性分析［J］. 食品科學(xué)， 2020， 41（24）：209-215.

［6］師聰， 解春芝， 張建萍， 等. 覆盆子不同極性溶劑提取物的抗氧化活性比較［J］. 食品科技， 2021， 46（1）：220-224.

［7］謝欣梅， 龐曉斌， 李曉婷. 覆盆子酮對(duì)糖尿病模型小鼠的降血糖作用及其機(jī)制研究［J］. 中國藥學(xué)雜志， 2012， 47（23）：1899-1904.

［8］張希， 廖宇嬌， 楊卓， 等. 覆盆子鹽制前后化學(xué)成分及藥效學(xué)變化研究［J］. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2020， 31（1）：140-142.

［9］王佳鸞， 趙俸藝， 張春紅， 等. 鞣花酸提取、純化及其生物活性研究進(jìn)展［J］. 食品工業(yè)科技， 2022， 43（13）：416-424.

［10］陳丹丹， 班曉敏， 林夏， 等. Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化壯藥黃杞中總黃酮的回流提取工藝［J］. 中國民族民間醫(yī)藥， 2022， 31（5）：46-51.

（收稿日期：2023-02-22? 編輯：劉? 斌）