周文淼, 王紅霞,2), 劉昆梅, 劉 菁,2), 屈昱良,2)*, 郭 樂,2)*

(1)寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 銀川 750004;2)寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院, 銀川 750004;3)寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦疾病重點(diǎn)實驗室, 銀川 750004)

泛素化(ubiquitination)是一種重要的翻譯后修飾(post-translational modifications, PTM)機(jī)制,由泛素或泛素鏈共價連接到目標(biāo)蛋白質(zhì)上,針對蛋白質(zhì)發(fā)揮降解性和非降解性的功能。泛素(ubiquitin, Ub)含有7個賴氨酸位點(diǎn)(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)和1個甲硫氨酸結(jié)合位點(diǎn)(M1),其形成直鏈或具有分支結(jié)構(gòu)的同型、異型多聚泛素鏈[1]。其中,發(fā)揮靶向蛋白酶體途徑降解蛋白質(zhì)的功能的多聚泛素鏈有K11或K48連接的同型泛素鏈、K48與K11/K29/K63連接組合的異型分支泛素鏈等[2, 3]。其余幾種多聚泛素鏈具有非降解性的功能。例如,K6連接的多聚泛素鏈參與蛋白質(zhì)穩(wěn)定、線粒體自噬和DNA損傷反應(yīng)等[4],K63連接的多聚泛素鏈通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用和活性影響免疫信號傳導(dǎo)等[3]。泛素化過程由一系列酶(E1泛素激活酶、E2泛素偶聯(lián)酶、E3泛素連接酶)介導(dǎo)。泛素化還是一種可逆過程,特定泛素連接的肽鍵或異肽鍵可以被多種去泛素化酶(deubiquitylating enzyme, DUB)水解[5]。在人體中,已發(fā)現(xiàn)2種E1、數(shù)十種 E2、600余種E3、約100種DUB[6, 7]。其中,E3決定泛素化底物蛋白質(zhì)的特異性[8]。

SMAD 特異性 E3 泛素蛋白連接酶 1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)是HECT結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶,屬于神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)蛋白4(neuronal precursor cell-expressed developmentally downregulated 4,NEDD4)家族,可催化K29、K33、K48、K63連接的多聚泛素鏈生成[9],介導(dǎo)降解性和非降解性的泛素修飾。研究表明,SMURF1主要調(diào)節(jié)TGF-β/BMP信號通路中的Smad蛋白質(zhì)穩(wěn)定性,在不同腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用[10]。然而,SMURF1的功能并不局限于此。另有研究發(fā)現(xiàn),SMURF1與自噬關(guān)系密切。例如:SMURF1能直接催化泛素與結(jié)核分枝桿菌共定位,進(jìn)而靶向選擇性自噬降解[11],泛素化修飾自噬成熟相關(guān)蛋白質(zhì)UVRAG (UV radiation resistance associated)促進(jìn)自噬小體成熟抑制肝癌細(xì)胞增殖[9],還可以在應(yīng)激狀態(tài)下增加p62斑點(diǎn)數(shù)量促進(jìn)自噬[12]。由此可見,SMURF1在自噬中發(fā)揮重要作用。同時,泛素連接酶與底物蛋白質(zhì)之間并非一一對應(yīng),一種泛素連接酶可以催化多種底物蛋白質(zhì)的泛素化修飾。因此,鑒定新的SMURF1泛素化底物蛋白質(zhì)對揭示其在自噬過程中的生物學(xué)功能至關(guān)重要。

RNA腺苷脫氨酶 1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)是一種廣泛存在于各種細(xì)胞中的RNA編輯酶,作用于雙鏈RNA,催化其腺苷-肌苷脫氨反應(yīng)。ADAR1分為兩種蛋白質(zhì)亞型,一種是干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的ADAR1-p150(150 kD),另一種則是組成型表達(dá)的ADAR1-p110(110 kD),兩種亞型在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均能夠檢測到。其中,ADAR1-p150主要位于胞質(zhì)中[13],ADAR1-p110主要位于胞核中[14]。ADAR1通過將腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷改變RNA序列和RNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,影響病毒生長、神經(jīng)遞質(zhì)功能、先天免疫反應(yīng)和癌癥進(jìn)展等[15-18]。

既往研究證實,SMURF1對骨髓來源的巨噬細(xì)胞自噬存在調(diào)控作用[11]。在本研究中,我們對THP-1人單核細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析,在此基礎(chǔ)上篩選新的SMURF1相互作用蛋白質(zhì)和泛素化底物蛋白質(zhì),并在HEK-293T細(xì)胞中針對SMURF1與潛在泛素化底物蛋白質(zhì)ADRA1的相互作用加以鑒定,進(jìn)一步闡明SMURF1對ADAR1的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性影響和泛素化修飾作用。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1人單核細(xì)胞購自南京科佰生物公司;HEK-293T細(xì)胞、E.coli感受態(tài)DH5α細(xì)胞、HA-Ub過表達(dá)載體均由本實驗室保存;pcDNA3.1(+)質(zhì)粒購自南京鐘鼎生物公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清購自上海逍鵬生物公司VivaCell;β-巰基乙醇、Lipofactamine TM3000轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、小鼠單抗Myc標(biāo)簽抗體購自美國Thermo Fisher公司;相關(guān)引物合成及過表達(dá)載體測序鑒定由上海生工生物公司完成;PCR mix、DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自北京全式金生物公司;全蛋白質(zhì)提取及定量相關(guān)試劑盒購自江蘇凱基生物公司;免疫沉淀磁珠及試劑盒購自廣州海貍生物公司;免疫沉淀裂解液和漂洗液購自北京蘭博利德生物公司;快速銀染試劑盒、無縫克隆試劑盒購自上海碧云天生物公司;MG132購自美國MCE公司;CHX購自美國AbMole公司;兔多抗RNA腺苷脫氨酶 1(ADAR1)、GAPDH、HA、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體均購自Proteintech公司;兔單抗SMURF1抗體購自英國Abcam公司;小鼠單抗SMURF1抗體購自美國Santa Cruz公司;兔Normal IgG 購自美國CST公司;蛋白質(zhì)譜分析由杭州聯(lián)川生物公司完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞用含15%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液、0.05 mmol/L β-巰基乙醇的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(5% CO2, 37 ℃),每1～2 d半量換液并混勻,當(dāng)密度達(dá)到1×106細(xì)胞/mL時進(jìn)行傳代。HEK-293T細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(5% CO2, 37 ℃),每1～2 d根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)、密度進(jìn)行傳代。

1.3 免疫共沉淀(Co-IP)

將細(xì)胞用PBS洗滌2次,加入含1 mmol/L PMSF的裂解緩沖液,混勻后冰上放置10 min,離心(4 ℃,14 000 g,10 min)收集上清,取20 μL作為全細(xì)胞裂解液對照組(WCL),其余細(xì)胞裂解液加入磁珠預(yù)混1～2 h,棄磁珠,保留上清置于冰上備用。將裂解緩沖液洗滌后的磁珠與抗體在室溫下輕輕翻轉(zhuǎn),15 min后進(jìn)行磁性分離,加入200 μL細(xì)胞裂解液,4 ℃反應(yīng)過夜后進(jìn)行磁性分離,用洗滌緩沖液將磁珠-抗體-抗原復(fù)合物洗滌3次并轉(zhuǎn)移到新的EP管中,向其中加入25 μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液(loading buffer),混勻,95 ℃加熱5 min,執(zhí)行磁性分離后收集上清進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4 蛋白質(zhì)銀染

將電泳后的凝膠固定,經(jīng)30%乙醇洗滌10 min,水洗滌10 min,棄水,加入銀染增敏液增敏2 min,水洗滌2次,棄水,加入銀溶液復(fù)染10 min,水洗滌1～1.5 min,棄水,加入銀染顯色液顯色3～5 min,直至出現(xiàn)比較理想的蛋白質(zhì)預(yù)期條帶加入銀染終止液,水洗滌2～5 min,拍照。

1.5 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過NCBI查詢SMURF1基因的CDS全長序列,設(shè)計N端融合Myc標(biāo)簽的SMURF1引物,以THP-1細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,使用PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,確認(rèn)產(chǎn)物大小與預(yù)期一致后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收,方便后續(xù)重組。使用BamHⅠ和EcoRⅠ 對pcDNA3.1(+)載體進(jìn)行雙酶切,將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將大片段進(jìn)行膠回收,使用無縫克隆試劑盒將其與SMURF1擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接,隨后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和增菌培養(yǎng)。挑取單克隆菌落置于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、200 r/min搖床上培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒,用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定SMURF1和pcDNA3.1(+)。另挑取單克隆菌落置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,送至生工生物進(jìn)行測序鑒定。

1.6 瞬時轉(zhuǎn)染

取適量對數(shù)期生長的HEK-293T細(xì)胞鋪在6孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到80～90%時,按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofactamine TM3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 分別將相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,培養(yǎng)24 h,直接收集細(xì)胞或用MG132、CHX處理指定時間后收集細(xì)胞,提取總蛋白質(zhì)。

1.7 免疫印跡分析

將蛋白質(zhì)樣品定量后加入6×蛋白質(zhì)上樣緩沖液和適量去離子水,95 ℃加熱10 min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5% BSA封閉1 h,加入相應(yīng)蛋白質(zhì)抗體于4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次,每次10 min,加入二抗置于室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,每次10 min,ECL發(fā)光顯影。

1.8 qRT-PCR

加Trizol裂解細(xì)胞提取總RNA,檢測RNA濃度和純度,逆轉(zhuǎn)錄得到產(chǎn)物cDNA,進(jìn)行qPCR檢測ADAR1、GAPDHmRNA表達(dá)水平。ADAR1正義鏈:5′-AGCACCTTCCATGACCAGATAG-3′,ADAR1反義鏈:5′-AGAGAAACCTGATGAAGCCTCTC-3′;GAPDH正義鏈:5′-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3′,GAPDH反義鏈:5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

每組實驗獨(dú)立重復(fù)3次,用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析并以GraphPad Prism9作圖。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗分析, 當(dāng)P<0.05時, 其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析篩選泛素連接酶SMURF1相互作用蛋白質(zhì)

為得到SMURF1相互作用蛋白質(zhì)集合物,取THP-1細(xì)胞1×107個制備裂解液。為排除非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合,分別利用IgG和SMURF1抗體進(jìn)行免疫共沉淀,并通過銀染法鑒定共沉淀樣本質(zhì)量。銀染結(jié)果顯示,Co-IP產(chǎn)物蛋白質(zhì)濃度較高,可用于蛋白質(zhì)譜鑒定(Fig.1A)。對以上樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示,IgG組共結(jié)合了481種蛋白質(zhì)、SMURF1共結(jié)合了607種蛋白質(zhì)。其中,能與SMURF1物理性結(jié)合的蛋白質(zhì)共222種,包括ADAR1(Fig.1B、Table 1)。蛋白質(zhì)譜分析檢測到的ADAR1的特異性肽段序列見Table 2。

Table 1 List of 10 proteins possibly binding to SMURF1

Table 2 Peptide sequence of ADAR1 detected by mass spectrometry

Fig.1 Screening of proteins possibly binding to SMURF1 (A) Cell lysates of THP-1 cells were immunoprecipitated with normal IgG or anti-SMURF1 antibodies. Then the quality of immunoprecipitates was tested by silver stain; (B) The overview of Mass spectrometry identification of interacting proteins

2.2 泛素連接酶SMURF1真核過表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

用帶Myc標(biāo)簽的SMURF1擴(kuò)增引物(Table 3)對模板進(jìn)行PCR,所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小在2 500 bp左右,與預(yù)期一致(Fig.2A)。將產(chǎn)物進(jìn)行膠回收,與雙酶切后的pcDNA3.1(+)載體連接制備重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳驗證和測序鑒定(附件2),結(jié)果表明,已成功將SMURF1基因全長序列構(gòu)建到pcDNA3.1(+)載體上(Fig.2B、C)。為了驗證SMURF1真核過表達(dá)載體效果,本文在HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SMURF1過表達(dá)載體。Western印跡結(jié)果顯示,與空載體pcDNA3.1(+)組相比,轉(zhuǎn)染SMURF1過表達(dá)載體后蛋白質(zhì)水平顯著升高,表明SMURF1過表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功,可用于下一步研究(Fig.2 D)。

Table 3 Amplification primers of SMURF1

Fig.3 Exogenous SMURF1 interacts physically with endogenous ADAR1 HEK-293T cells were transfected with Myc-SMURF1 recombinant plasmids or pcDNA3.1(+) plasmids. After 24 hours, cells were treated with MG132 (20 μmol/L) for 8 hours. Cell lysates were used for co-immunoprecipitation with anti-ADAR1 (A) or anti-Myc (B) antibodies and normal rabbit IgG was used as the control. Western Blotting was carried out with indicated antibodies

2.3 泛素連接酶SMURF1與RNA腺苷脫氨酶 1存在相互作用

為了進(jìn)一步探明SMURF1與ADAR1的作用關(guān)系,本研究在HEK-293T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空載體和SMURF1過表達(dá)載體,24 h后用蛋白酶體抑制劑MG132(20 μmol/L)處理8 h,裂解細(xì)胞,用ADAR1抗體和Myc標(biāo)簽抗體分別做Co-IP,Western印跡檢測ADAR1和SMURF1結(jié)合情況。結(jié)果正如Fig.4A、B所示,SMURF1與ADAR1存在相互作用,提示SMURF1與ADAR1具備泛素化修飾的空間基礎(chǔ)。

Fig.4 The Ubiquitin ligase SMURF1 negatively regulates ADAR1 protein levels (A) HEK-293T cells were transfected with Myc-SMURF1 recombinant plasmids or pcDNA3.1(+) plasmids, and endogenous ADAR1 was analyzed by qRT-PCR. ns: no significance, P>0.05, n=3. (B) HEK-293T cells were transfected with Myc-SMURF1 recombinant plasmids or pcDNA3.1(+) plasmids, and the protein levels of ADAR1, SMURF1, GAPDH were examined by Western blotting. (C) The bar chart represents the quantitative data of the relative protein levels of total ADAR1 after overexpression of SMURF1. The values were normalized to GAPDH. Compared with the negative control group,*P<0.05, n=3

Fig.5 Overexpression of SMURF1 diminishes ADAR1 protein stability (A) Cells overexpressing SMURF1 were treated with CHX (400 μmol/L) for 0, 30, 60, 90 minutes. The protein levels of ADAR1, SMURF1, GAPDH were examined by Western blotting. The experiment was repeated for three times and a representative result is shown. (B) The line chart represents the quantitative data of (A), and the values were normalized to GAPDH

2.4 泛素連接酶SMURF1在非轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)控RNA腺苷脫氨酶 1表達(dá)

作為SMURF1的相互作用蛋白質(zhì),ADAR1是否受SMURF1表達(dá)變化的影響仍未可知。本研究在HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染SMURF1過表達(dá)載體,24 h后提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測ADAR1、SMURF1的mRNA水平,提取總蛋白質(zhì)用Western印跡檢測ADAR1、SMURF1、GAPDH的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果正如Fig.3 A所示,在HEK-293T細(xì)胞中過表達(dá)SMURF1后,與對照組(1.00±0.057)相比,SMURF1過表達(dá)組(0.998±0.25)ADAR1的相對mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。然而在過表達(dá)SMURF1后,與對照組(1.00±0.047)相比,ADAR1蛋白質(zhì)水平(0.67±0.16)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示SMURF1在非轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ADAR1蛋白質(zhì)的水平?？紤]到SMURF1能催化多聚泛素化修飾,本文推測,SMURF1過表達(dá)極有可能增強(qiáng)ADAR1的泛素化修飾,并介導(dǎo)后者的降解。

2.5 過表達(dá)泛素連接酶SMURF1降低RNA腺苷脫氨酶 1穩(wěn)定性

在過表達(dá)SMURF1后,用CHX(400 μmol/L)處理0、30、60、90 min,Western印跡檢測ADAR1、SMURF1、GAPDH的蛋白質(zhì)水平,用以探索SMURF1對ADAR1蛋白半衰期的影響。結(jié)果正如Fig.6A、B所示,用CHX處理90 min后,與對照組(0.88±0.086)相比,過表達(dá)SMURF1組的ADAR1蛋白質(zhì)水平(0.48±0.20)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明過表達(dá)SMURF1可使ADRA1半衰期縮短。

Fig.6 SMURF1 catalyzes the polyubiquitination of ADAR1 and may mediate its proteasome pathway-dependent degradation (A) HEK-293T cells were co-transfected with indicated plasmids. After 24 hours, cell lysates were used for co-immunoprecipitation with anti-ADAR1 antibodies. Western blot was performed to examine the polyubiquitination levels of ADAR1 with anti-HA antibodies. (B) Cells overexpressing SMURF1 were treated with DMSO or MG132 (20 μmol/L) for 8 hours. The protein levels of ADAR1, SMURF1, GAPDH were tested by Western blotting. The experiments were repeated for three times and representative results are shown

2.6 泛素連接酶SMURF1催化RNA腺苷脫氨酶 1發(fā)生多聚泛素化

基于以上發(fā)現(xiàn),本文推測,SMURF1可能通過催化ADAR1多聚泛素化修飾介導(dǎo)其蛋白酶體途徑降解,進(jìn)而影響ADAR1蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在HEK-293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Myc-SMURF1、HA-Ub或pcDNA3.1(+)質(zhì)粒,收集細(xì)胞進(jìn)行Co-IP和Western印跡檢測。結(jié)果正如Fig.6A所示,SMURF1過表達(dá)增強(qiáng)了ADAR1的多聚泛素化水平。為了驗證SMURF1促進(jìn)ADAR1降解的途徑,本文在過表達(dá)SMURF1 24 h后,用MG132(20 μmol/L)處理8 h,Western印跡檢測ADAR1、SMURF1、GAPDH的蛋白質(zhì)水平。結(jié)果正如Fig.6 B所示,過表達(dá)SMURF1后,與DMSO處理的對照組(0.81±0.10)相比,用MG132處理阻斷蛋白酶體降解途徑后ADAR1的蛋白質(zhì)水平(1.07±0.09)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),即SMURF1對ADAR1的負(fù)調(diào)控作用減弱,提示SMURF1催化ADAR1的多聚泛素化修飾可能介導(dǎo)其蛋白酶體途徑依賴性降解。

3 討論

E3泛素連接酶包括RING(really interesting new gene)、U-box(UFD2 homology)、RBR(RING-between-RING)、 HECT(homologous to E6-AP carboxy terminus)四大類,其中前兩者可能由E2決定泛素鏈連接特異性,而后兩者由E3本身決定[3]。SMURF1屬于HECT類泛素連接酶,催化K48、K63、K29、K33泛素鏈生成進(jìn)而發(fā)揮多種生物學(xué)功能,不僅能在自噬方面與腫瘤發(fā)生發(fā)展、抗結(jié)核分枝桿菌感染上發(fā)揮作用,還能泛素化多種底物蛋白質(zhì)進(jìn)而在肝脂肪變性、成骨分化、神經(jīng)退行性病變、腎纖維化和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[19-23]。

RNA編輯是通過核苷酸修飾、插入或缺失來改變RNA分子的一種重要的轉(zhuǎn)錄后加工形式。在RNA編輯類型中,最為常見的是將腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷,由RNA腺苷脫氨酶(adenosine deaminases acting on RNA,ADARs)催化。目前ADAR家族已鑒定出ADAR1、ADAR2、ADAR3三種類型。研究表明,ADAR1和ADAR2具有編輯酶活性,而ADAR3不具備催化活性且能抑制ADAR1和ADAR2的編輯作用[24]。三種類型中,ADAR1的表達(dá)最為普遍[24]。ADAR1通過將腺苷水解脫氨轉(zhuǎn)化為肌苷,不僅可以調(diào)節(jié)微小RNA(miRNA)和內(nèi)源性短干擾RNA(esiRNA)的加工和后續(xù)功能[25],還作用于長鏈非編碼RNA和mRNA非翻譯區(qū)(UTR),通過核保留、翻譯調(diào)節(jié)和降解影響基因表達(dá)[26]?，F(xiàn)階段ADAR1是否調(diào)控自噬仍鮮有研究。然而,大量研究表明自噬廣泛地受到非編碼RNA的調(diào)節(jié)[27]。因此可以推測ADAR1的蛋白質(zhì)水平的變化可能通過作用于非編碼RNA進(jìn)而調(diào)控自噬。

既往研究表明,ADAR1受到降解性和非降解性的泛素化修飾,泛素連接酶FBXW1A在干擾素誘導(dǎo)作用下促進(jìn)ADAR1的多聚泛素化降解[28],Smad泛素調(diào)節(jié)因子2(SMURF2)催化ADAR1的泛素化修飾進(jìn)而上調(diào)其蛋白質(zhì)水平[14]。本文研究發(fā)現(xiàn),SMURF1催化ADAR1發(fā)生多聚泛素化,影響ADAR1蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。雖然研究顯示SMURF1可以通過增加泛素與自噬底物的共定位、調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白質(zhì)達(dá)到直接促進(jìn)自噬的作用[9, 11, 12],但也不排除SMURF1可以通過其他途徑間接影響自噬。SMURF1是否會通過ADAR1的RNA編輯作用影響自噬?假設(shè)SMURF1確實能通過對ADAR1的泛素化修飾進(jìn)而調(diào)控自噬,那么除了通過非編碼RNA對自噬發(fā)揮調(diào)控作用外,模式識別受體和 Ⅰ 型干擾素介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)也可能成為其調(diào)控機(jī)制中的環(huán)節(jié)。ADAR1-p150可以通過抑制模式識別受體激活抑制先天免疫和干擾素反應(yīng),ADAR1-p110在應(yīng)激反應(yīng)中抑制mRNA衰變而發(fā)揮抗凋亡作用,二者在抗病毒和腫瘤免疫過程中發(fā)揮雙重作用[17]。另外,ADAR1還可以在編輯或不編輯RNA的情況下影響miRNA的表達(dá)和功能[17],使得ADAR1的間接調(diào)控功能更為復(fù)雜多變。并且在SMURF1作用下,ADAR1是否會發(fā)揮其他非降解性的泛素化修飾仍未可知。因此,SMURF1對ADAR1的泛素化修飾作用最終是否會調(diào)控自噬以及調(diào)控的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

THP-1人單核細(xì)胞是研究細(xì)胞自噬的主要細(xì)胞系,本研究針對SMURF1在THP-1細(xì)胞中的相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選,在HEK-293T細(xì)胞過表達(dá)SMURF1,探索SMURF1對ADAR1蛋白質(zhì)水平及其泛素化水平之間的調(diào)控作用。最終本文發(fā)現(xiàn),E3泛素連接酶SMURF1催化ADAR1蛋白質(zhì)的多聚泛素化修飾并介導(dǎo)其降解,豐富了ADAR1的調(diào)節(jié)機(jī)制,為探索SMURF1通過影響ADAR1蛋白質(zhì)穩(wěn)定性而具備的多種生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。