吳 苑, 黎祖鳴, 吳思儀, 陳劍坤, 李際強*, 陳 海*, 蔡書賓*

(1)廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院, 廣州 511400;2)廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院, 廣州 511400)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea, OSA)以打鼾、頻繁的淺呼吸、呼吸暫停、低氧血癥、夜間睡眠障礙和白天嗜睡為特點,而間歇性低氧(intermittent hypoxia, IH)是OSA一個關鍵病理生理過程[1, 2]。世界范圍內,OSA的患病率約為17%[3]。許多研究顯示,OSA與高血壓、冠心病、中風以及其他心腦血管疾病密切相關[4-6]。由于目前診斷方法的復雜性和持續(xù)氣道正壓通氣(continuous positive airway pressure, CPAP)治療較差的依從性,目前OSA患者的診斷和治療率很低。因此,從臨床和理論的角度而言,有必要進行對OSA進一步深入研究。

隨著轉錄物組測序等高通量技術的發(fā)展,研究人員通過分析OSA的miRNA表達譜[7, 8],以研究表觀基因組調控在OSA發(fā)生和發(fā)展中的作用。環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)是一種內源性非編碼RNA,與miRNA不同的是,它形成一個閉環(huán)結構,是基因轉錄的重要組成部分,其末端有一個5′端和一個3′端[9]。幾乎所有物種中都表達circRNA,且具有疾病特異性,因其可抵御RNA酶的降解,與線性RNA相比,具有更高的組織和循環(huán)穩(wěn)定性[10]。circRNA的另一個特點是它的“miRNA海綿”功能,它能有效地降低miRNA的表達,以進一步調節(jié)下游mRNA的表達[11]。既往研究表明,circRNA在腫瘤、心血管和神經系統(tǒng)疾病等中發(fā)揮著至關重要的作用[12-15]。本研究擬通過轉錄物組測序、生物信息學和實時熒光定量法(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)驗證等方法,對OSA大鼠模型的circRNA和mRNA譜進行分析,并構建circRNA-miRNA-mRNA調控網絡,以期為闡明OSA的發(fā)生機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周大的SPF級Wistar雄性大鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心[許可證號SCXK(粵)2013-0002],體重180～200克,自由攝入食物和取水,飼養(yǎng)條件:室溫20～26 ℃,相對濕度40%～70%,實行12 h∶12 h光暗照明循環(huán),保持動物房環(huán)境安靜。根據是否進行缺氧處理分為缺氧組(IH)和對照組(NC)。本研究已經廣州中醫(yī)藥大學生物醫(yī)學倫理委員會動物福利與倫理分會批準(編號2019011)。

1.2 儀器和試劑

儀器:PCR擴增儀(Applied Biosystems,美國)、酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo,美國)、熒光定量PCR儀(伯樂公司,美國),illumina Hiseq X10測序儀(Illumina,美國)。

試劑:Rnase R(Epicentre,Madison,USA)、Arraystar Super RNA Labeling 試劑盒(Arraystar, Rockville, USA)、小鼠白介素6(interleukin-6, IL-6)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(Abcam, Cambridge, UK)。

1.3 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型的構建

為構建OSA動物模型,每天8:00到16:00之間將雄性Wistar大鼠關在同一個IH有機玻璃室中,最初向室內輸送氮氣,持續(xù)90 s。然后,該室被填充壓縮空氣,持續(xù)90 s。因此,每個周期共持續(xù)180 s。在IH期間,氣體流速設定為每個循環(huán)玻璃室中最低氧氣濃度的5%,并逐漸恢復到21%,玻璃室的壓力保持在大氣水平。而對照組持續(xù)暴露在21%的氧氣中。在非實驗時間(16∶00-08∶00)期間,所有的動物都正常攝入水和食物[16],實驗周期共4周。造模4周后,皮下注射水合氯醛麻醉缺氧組和對照組大鼠,取血、支氣管和肺組織后,大鼠被脫臼處死。

1.4 蘇木精-伊紅染色觀察阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠支氣管和肺組織病理變化

各組大鼠左側支氣管和肺組織在室溫下采用4%多聚甲醛固定過夜,在梯度濃度乙醇中脫水(70%、80%、90%和100%);將組織浸入二甲苯中直至透明,在60 ℃石蠟中包埋2 h;將組織塊切成5 μm薄片,在水中攤開并轉移到載玻片上,于60 ℃干燥24 h;將切片在二甲苯中脫蠟,以梯度濃度乙醇(100%、95%、85%和75%)中脫水;切片在蘇木精中染色5 min,沖洗后使用伊紅染色3 min,在梯度濃度乙醇中脫水(每次2 min,分別以75%、85%、95% 的比例脫水; 每次5 min,以100% 的比例脫水),在二甲苯中透明2次,每次10 min;使用中性樹膠封片,在光學顯微鏡下觀察組織厚度、炎癥細胞浸潤、水腫和出血等情況。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中炎癥因子水平

各組大鼠進行腹主動脈采血,靜置2 h,室溫下3 500 r/min離心10 min,取上清,按照ELISA試劑盒說明檢測血清中IL-6、VEGF、TNF-α和ICAM-1的表達水平。

1.6 CircRNA和mRNA差異分析及質量控制

通過Qubit 2.0對RNA濃度進行初步定量,分光光度計檢測總RNA的濃度及純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA降解程度、基因組DNA污染和蛋白質污染,以及Agilent 2100檢測RNA的完整性及插入片段大小等質量控制,結果提示樣品質量合格。

丟棄含有20%以上的低質量堿基或適配序列污染的低質量讀數(shù),用BWA(v0.7.12)[17]memalignment模塊將高質量的讀數(shù)與人類參考基因組(hg19)對比。使用CIRI軟件[18]對circRNA進行識別和定性,其過程如下:首先,丟棄與基因組連續(xù)對齊的讀數(shù),不作任何修剪;剩余的讀數(shù)被用于circRNA候選檢測;再提取終端序列(錨)并重新對齊,以找到獨特的錨位置,以反方向(頭對尾)對齊的錨表示circRNA的拼接(反拼接);最后,用以下標準來過濾所產生的剪接事件:(1)剪接位點兩側的GT/AG信號;(2)明確的斷點檢測;(3)延伸過程中不超過2個錯配;(4)斷點位于錨點內最多2個核苷酸;(5)支持頭到尾剪接接頭的獨立讀數(shù)少于2個。跨越1個確定的反接點的讀數(shù)被歸一化,由讀數(shù)映射(spliced tags reads per million mapping, TPM),這允許在2個circRNA之間進行表達比較。使用已報道的統(tǒng)計模型[19]對2個樣本進行差異表達分析。P<0.05和差異倍數(shù)≥2的circRNA認為是差異表達的circRNAs。

丟棄低質量讀數(shù)后用HISAT[20]以默認參數(shù)與人類基因組(hg19)進行比對。使用RSeQC[21]測量基因表達豐度,即每百萬映射讀數(shù)中的每千堿基讀數(shù)(reads per kilobase per million mapped reads, RPKM)。使用heatmap R包進行所有樣本的無監(jiān)督聚類,得出差異mRNA。

1.7 預測和富集分析

使用TargetScan[22]和miRanda[23]在線分析工具預測circRNA-miRNA和miRNA-mRNA的相互作用關系。采用R包clusterProfiler、enrichplot、GOplot、ggplot2對差異的circRNA和mRNA進行基因本體論(Gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析及可視化。其中,GO分析包括生物學過程(biological process, BP)、細胞組成(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)。

1.8 關鍵RNA的qRT-PCR驗證

根據試劑盒的說明,每個支氣管組織樣本分別與聚丙烯載體(MRC,OH,USA)、TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和氯仿混合以提取總RNA。常規(guī)使用RNeasy Mini 試劑盒以提純RNA(Qiagen,Hilden,德國)。然后,使用NanoDrop 2000(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)檢測RNA的純度和濃度。使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa,中國大連),將OSA組和對照組的支氣管樣本提取的RNA按照試劑盒的說明反轉錄成cDNA。采用以下PCR擴增設置:在95 ℃下進行15 s的初始變性步驟,然后進行35個循環(huán),在95 ℃下變性5 s,在61 ℃下退火15 s。使用SYBR Green PCR試劑盒(TaKaRa,中國大連),對關鍵的mRNA和circRNA進行qRT-PCR驗證。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 構建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠模型

在IH有機玻璃室內進行缺氧和復氧循環(huán)4周,IH組大鼠的體重急劇增加(Fig.1A);取大鼠左側肺和支氣管組織,HE染色后于顯微鏡下觀察,結果提示,與對照組相比,IH組的大鼠普遍出現(xiàn)肺泡壁和支氣管組織變厚、炎癥細胞浸潤、水腫和出血等情況(Fig.1B); ELISA檢測血清中炎癥因子水平,結果表明,與對照組相比,IH組的大鼠血清中IL-6(352.36±43.82比191.32±63.65,P=0.023)、VEGF(8.65±0.21比1.41±0.32,P<0.001)、TNF-α(7.51±0.7比2.89±0.97,P=0.003)和ICAM-1(1.34±0.11比0.83±0.01,P=0.001)的水平明顯上升(Fig.1C)。以上結果表明,OSA大鼠模型構建成功。

Fig.1 Construction and verification of the IH rat model (A) Body weights of rats in different groups. (B) Histological sections of bronchial and lung tissues from different groups of rats (hematoxylin and eosin staining; magnification × 200, scale bar=300 μm). (C) The concentrations of ICAM-1, IL-6, VEGF and TNF-α were determined by ELISA. NC control group, IH OSA group. (*P <0.05, **P <0.01,****P <0.0001)

2.2 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠模型circRNA和mRNA的表達譜分析

每組隨機抽取1個支氣管樣本進行circRNA和mRNA測序。差異表達分析結果顯示,共有411個差異表達的circRNA,其中表達上調的circRNA有230個,表達下調的circRNA有181個(Fig.2A),差異表達的circRNA在染色體上的分布正如Fig.2B所示;共有1 846個差異表達的mRNA,其中表達上調的mRNA有1 238個,表達下調的mRNA有608個(Fig.3A),差異表達的mRNA在染色體上的分布正如Fig.3B所示。差異倍數(shù)最大的前6個circRNA(Table 1)和mRNA(Table 2)定義為關鍵RNA。

Table 1 Top 6 significantly dysregulated circRNAs in IH

Table 2 Top 6 significantly dysregulated mRNAs in IH

Fig.2 Analysis of circRNAs with differential expression in the OSA rat model using bioinformatics (A) A scatter plot (left panel) and heat map (right panel) illustrate the distributions of cicRNAs. (B) Distribution of differentially expressed circRNAs on chromosomes. (C) KEGG pathway analysis of differentially expressed circRNAs. (D) GO pathway analysis of differentially expressed circRNAs. NC control group, IH OSA group

Fig.3 Analysis of differentially expressed mRNAs in the IH rat model using bioinformatics The distributions of mRNAs were more clearly displayed in (A) scatter plots (left panel) and heat maps (right panel). (B) Distribution of differentially expressed mRNAs on chromosomes. (C) KEGG pathway analysis of differentially expressed mRNAs. (D) GO pathway analysis of differentially expressed mRNAs. NC control group, IH OSA group

2.3 關鍵RNA功能富集分析

對關鍵的circRNA和mRNA進行富集分析。關鍵circRNA的KEGG結果表明,其主要富集在代謝通路、PI3K-Akt信號通路和焦點黏附等通路,Fig.2C展示了KEGG前20條通路。GO富集分析結果表明,差異基因主要參與細胞周期相關過程、生物調節(jié)和代謝過程等生物學過程,差異基因產物主要分布于細胞、組成細胞的各種化學成分和細胞器等細胞成分,參與了結合、催化活性、分子功能調節(jié)器等分子功能(Fig.2D)。

關鍵mRNA的 KEGG結果表明,其主要富集在代謝途徑、PI3K-Akt信號途徑和細胞黏附分子等通路,Fig.3C展示了KEGG前20條通路。GO富集分析結果表明,差異基因參與細胞周期相關過程、生物調節(jié)和代謝過程等生物學過程,差異基因產物主要分布于細胞、組成細胞的各種化學成分和細胞器等細胞成分,參與了結合、催化活性、分子轉導活性等分子功能(Fig.3D)。

2.4 關鍵mRNA和circRNA的qRT-PCR驗證

通過qRT-PCR驗證關鍵mRNA(Table 2)。其中,Csap1(169.55±11.36比0.97±0.78,P<0.0001)、Ctrb1(2.79±0.35比1±0.08,P=0.001)、Dlx2(1.78±0.19比1.04±0.35,P=0.032)、Mab21l2(1.55±0.13比0.9±0.09,P=0.002)在IH組的表達水平較NC組明顯升高,Gnmt的表達在兩組間無明顯差異(1.02±0.09比0.98±0.09,P=0.612),Glycam1在IH組的表達水平較NC組明顯降低(0.77±0.05比0.99±0.09,P=0.021)。其中,Csap1和Ctrb1的表達與測序結果一致,Glycam1、Dlx2和Mab21l2的表達與測序結果相反,而Gnmt的表達與測序結果相似(Fig.4A)。即通過qRT-PCR成功驗證了關鍵mRNA中的Csap1和Ctrb1的mRNA表達。

Fig.4 The qRT-PCR analysis of chosen mRNAs and circRNAs (A) The expression of chosen mRNAs. (B) Analysis of circRNA cyclization by sanger sequencing and agarose gel electrophoresis. (C) The expression of selected circRNAs in qRT-PCR verification. NC control group, IH OSA group. (*P < 0.05,**P <0.01, ***P <0.001, sample size in each group, n=3)

通過sanger測序和瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證關鍵circRNA(Table 2)。其中,chr17∶2440591|27442626的測序不成功,而chr9∶54232163|54235344的測序是雙峰,其他4個circRNA可成功測序并進一步通過qRT-PCR檢測其表達(Fig.4B)。通過qRT-PCR驗證所選擇的4個circRNA(Fig.4C)。與測序結果不同的是,IH組和NC組相比,chr4∶58714647|58725647(1.19±0.12比1±0.02,P=0.053)和chr15∶55151603|55154467(1.04±0.04比0.99±0.07,P=0.349)的表達水平無明顯的差異。與NC組相比,IH組的chr9∶52042693|52047844(2.03±0.12比1±0.08,P<0.001)和chr4∶64889575|64899587(0.62±0.04比0.98±0.03,P<0.001)的表達水平具有明顯的統(tǒng)計學差異,且與測序結果一致。即通過qRT-PCR成功驗證了關鍵circRNA中的chr9∶52042693|52047844和chr4∶64889575|64899587的表達,可用以進一步構建ceRNA調控網絡。

Table 3 The construction of circRNA-miRNA-mRNA

2.5 ceRNA調控網絡的構建與驗證

使用TargetScan[22]和miRanda[23]在線分析工具,對qRT-PCR成功驗證的circRNA和mRNA進行circRNA-miRNA與miRNA-mRNA相互作用關系的預測分析。TargetScan分析結果提示,chr4∶64889575|64899587與rno-miR-181a-5p和rno-miR-320-3p有互作關系,chr9∶52042693|52047844與rno-miR-145-5p和rno-miR-351-5p有相互作用關系;miRanda分析結果提示,OSA大鼠支氣管差異表達的mRNA中,Creb1能作為rno-miR-181a-5p的靶基因,Igf1r可作為rno-miR-320-3p的靶基因,Tsc2能作為rno-miR-145-5p的靶基因,Pten可作為rno-miR-351-5p的靶基因(Table 3)。即chr4∶64889575|64899587-rno-miR-181a-5p-Creb1,chr4∶64889575|64899587-rno-miR-320-3p-Igf1r,chr9∶52042693|52047844-rno-miR-145-5p-Tsc2和chr9∶52042693|52047844-rno-miR-351-5p-Pten是與OSA發(fā)生發(fā)展?jié)撛谙嚓P的ceRNA網絡。

對潛在的4條ceRNA網絡組成分子(Fig.5A)在肺組織和支氣管組織中的表達進行qRT-PCR驗證,結果表明,miR-181a-5p、miR-145-5p、Crebl和Igf1r在肺組織和支氣管組織的表達趨勢不一致,miR-320-3p、miR-351-5p 在肺組織與支氣管組織中表達趨勢一致,chr4∶64889575|64899587、chr9∶52042693|52047844、Tsc2和Pten在肺組織與支氣管組織中表達趨勢均與測序數(shù)據一致,即成功驗證chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten這一ceRNA調控網絡(Fig.5B, Table 4)。

Table 4 The qRT-PCR analysis of circRNA-miRNA-mRNA

Fig.5 Construction and verification of circRNA-miRNA-mRNA networks (A) Construction of the circRNA-miRNA-mRNA networks. (B)The qRT-PCR analysis of constructed circRNA-miRNA-mRNA pathways in both bronchus and lung tissues. NC control group, IH OSA group. (*P <0.05, **P <0.01,****P <0.0001, sample size in each group, n=3)

3 討論

間歇性缺氧是OSA一個特征性的病理生理改變,然而,其發(fā)生發(fā)展的具體分子機制尚不明確。circRNA最初于1979年在真核生物的細胞質中發(fā)現(xiàn)[24],與疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關,同時也是miRNA的調節(jié)器。circRNA能穩(wěn)定地存在于血液和唾液中[25-27],對miRNA發(fā)揮長效抑制作用[28],參與調控人類的免疫反應和細胞代謝等生命活動。因此,本文采用生物信息學、轉錄物組測序和qRT-PCR驗證相結合的方法,研究OSA發(fā)生間歇性缺氧的分子機制。

本研究發(fā)現(xiàn),在OSA中明顯差異表達的6個circRNA尚未見文獻報道,但它們選擇性轉錄的mRNA參與了各種各樣的細胞活動。既往研究表明,Mkln1,即chr4∶58714647|58725647的線性轉錄物,參與細胞基質的構建,其促進細胞黏附[29, 30]。col3a1(chr9∶52042693|52047844的線性轉錄物)在慢性間歇性缺氧小鼠的頦舌肌組織中差異表達,與OSA上呼吸道肌肉損傷有潛在相關性[31];非典型激酶RIOK1(Chr17∶27440591|27442626的線性轉錄物),可以促進腫瘤的生長和侵入[32-34]。chr15∶55151603|55154467的線性轉錄物RB1與腫瘤發(fā)生相關[35]。Creb3l2是一種cAMP反應元件結合蛋白質,是Chr4∶64889575|64899587的線性轉錄物,可以治療低糖基化[36]。Gls是Chr9∶54232163|54235344的線性轉錄物,其過度活動可導致谷氨酸過剩,Gls缺失會降低乳腺腫瘤微血管密度,增加血管周圍支持細胞覆蓋率,改善灌注,減少缺氧[37, 38];同時,Gls還對Th17和Th1細胞分化及相關炎癥反應有調控作用[39]。

在OSA中明顯差異表達的6個mRNA中,唾液蛋白Csap1上調幅度最大,GlyCAM1在過敏性肺部炎癥肺組織中差異表達,與中央記憶型T細胞在肺部的浸潤相關[40],血液中GlyCAM1會中和炎癥刺激后的白細胞釋放的L-selectin[41, 42]。Dlx2表達水平降低與腫瘤轉移密切相關[43];白內障與MAB21L2的突變有關[44],Gnmt在肝炎、動脈粥樣硬化、潰瘍性結腸炎等炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[45, 46]。對表達下調的mRNA進行GO富集分析,結果表明,其主要富集在細胞周期相關過程等生物學過程,結合、催化活性和分子轉導器活性等分子功能。關鍵circRNA和mRNA的KEGG分析結果均提示,代謝和PI3K-Akt信號通路在OSA發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。本研究中,通過qRT-PCR對關鍵mRNA進行驗證,部分mRNA結果與測序結果不一致,原因可能與驗證基因數(shù)量較少、表達量低、方法學差異等因素相關。

考慮到circRNA-miRNA和miRNA-mRNA在OSA中級聯(lián)放大的影響,circRNA-miRNA-mRNA的調控網絡可能是其關鍵的調節(jié)途徑。本研究中驗證的chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten調控網絡尚未見文獻報道,但其中的分子分別與一些病理生理過程相關。在缺血/再灌注中,miR-351-5p是一個關鍵的標志物和治療靶標[47];研究表明,miR-351能同時靶向血管緊張素II和VEGF,介導二者在缺氧引起的微血管功能異常中的串擾[48];同時,對大鼠心肌細胞進行研究,結果表明,miR-351-5p能抑制PTEN表達,推動細胞促炎癥環(huán)境的建立[49]。以上結果表明,chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten調控網絡可能在OSA缺氧和炎癥反應等病理生理過程中扮演重要角色。本研究存在一定的局限性,因缺乏臨床樣本,未進一步在人類組織中對chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten調控網絡作進一步的驗證,后續(xù)研究將收集人類血液樣本深入研究。

本研究結果表明,chr9∶52042693|52047844-miR-351-5p-Pten可能通過ceRNA機制參與阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的發(fā)生和發(fā)展。